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研究背景:血管平滑肌细胞是动脉血管壁的主要细胞成分,对维持血管正常功能起重要作用。在动脉粥样硬化斑块形成过程中,血管平滑肌细胞的增殖、凋亡受机械应力、氧化型低密度脂蛋白、NO、活性氧簇及细胞成分能等多种因素共同影响。血管平滑肌细胞不协调的增殖及凋亡不仅促进了加快粥样硬化斑块长,而且与斑块不稳定和支架内再狭窄密切相关。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9,pcsk9)是涉及常染色体显性遗传性高胆固醇血症的第三个基因。主要表达于肝、肠、肾、脑等多组织器官,并且在动脉粥样硬化斑块、血管平滑肌、内皮细胞、单核巨噬细胞中均可检测到其表达。最新研究发现,PCSK9不仅在胆固醇的动态平衡中扮演关键角色,而且在炎症反应、细胞迁移、凋亡中均有重要作用。运用RNA干扰技术沉默PCSK9基因,可抑制由oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞、脐静脉血管内皮细胞的凋亡。而对于PCSK9基因沉默后对血管平滑肌细胞增殖、凋亡的作用及其机制国内外未见报导。目的:运用siRNA技术沉默PCSK9基因,观察其对血管平滑肌细胞增殖及凋亡的影响并探讨可能的相关机制。方法:1.血管平滑肌细胞复苏、培养、传代、冻存。2.PCSK9 siRNA模型的建立:设计3对针对PCSK9基因不靶点的siRNA序列,脂质体介导转染入细胞,选取转染效率高且对PCSK9表达抑制效率高的siRNA进行后续实验。3.siRNA抑制PCSK9基因对血管平滑肌细胞增殖的影响:取对数生长期的细胞,以每孔3×104个细胞密度接种于96孔板中,设计分为:空白组(未加PDGF+转染试剂)、阴性转染组(10ng/mlPDGF-BB+未转染 PCSK9siRNA)、阳性转染组(10ng/ml PDGF-BB+转染PCSK9 siRNA);每组6个孔。分别于12、24、36、48、60小时用MTT法测定OD值,绘制增殖曲线,观察PCSK9siRNA其对PDGF诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响;并于48小时检测LRP-1(中文名称)蛋白的表达,探讨PDGF在其中起的作用。4.siRNA抑制PCSK9基因对血管平滑肌细胞凋亡的影响:取对数生长期的细胞,以每孔3-5×105个细胞接种于6孔板中,设计三组分别为:空白组(未加ox-LDL+转染试剂)、阴性转染组(100 μg/mlox-LDL+转染阴性 PCSK9 siRNA)、阳性转染组(100 μg/mlox-LDL+转染PCSK9 siRNA);每组3个孔;培养24小时后。Hoechst33342染色,荧光显微镜下观察到细胞凋调亡形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡;结果:1、80nmol/L的PCSK9siRNA抑制血管平滑肌细胞PCSK9 mRNA及蛋白表达的效果最明显;2、10ng/ml PDGF-BB 处理 VSMC 12、24、36、48、60h 后,与阴性转染组相比,实验组OD值明显下降,说明转染PCSK9 siRNA后能有效抑制由PDGF诱导的血管平滑肌增殖作用(P<0.05)Western blot结果表明,LRP-1可能在其中起重要作用。3、100μ g/ml的oxLDL处理24h后,流式细胞术检测细胞凋亡,发现空白组平滑肌细胞凋亡率为2.68%;阴性对照组为19.40%;实验组转染组凋亡率为4.70%;结论:1、PCSK9siRNA能有效抑制血管平滑肌细胞PCSK9mRNA及蛋白的表达。2、PCSK9siRNA能有效抑制由PDGF介导的血管平滑肌细胞的增殖作用,LRP-1可能在其中起重要作用。3、PCSK9 siRNA可抑制oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡的作用。