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新城疫（Newcastle disease, ND）是严重危害禽业的传染病之一，世界动物卫生组织(OIE)将此列为必报传染病。预防 ND 的主要手段以接种疫苗为主，目前市场上主要的疫苗对基因VII型ND保护效果欠佳，因此研究针对基因VII型ND疫苗具有重要意义。 DNA疫苗作为继第一代疫苗（微生物疫苗）和第二代疫苗（亚单位疫苗）后的第三代疫苗，能诱导体液免疫和细胞免疫。为了研究针对基因VII型ND的DNA疫苗，本研究将真核表达密码子优化的F基因连接到真核表达载体pYA4545上，构建了CMV启动子控制的真核表达质粒pYA4545-pUC-F-opt-Flag，命名为pYA4545-F。为了增强免疫效果，将含有原核启动子Ptrc的鸡白介素18（chicken interferon 18, cIL-18）基因片段连接到pYA4545-F上，构建双启动子共表达的pYA4545-pUC-F-opt-Ptrc-cIL18-TT-Flag质粒，命名为pYA4545-F-IL18。分别将pYA4545-F及pYA4545-F-IL18质粒电转到延迟裂解型沙门菌载体χ11218中，口服免疫雏鸡后评价其免疫效应。具体研究内容及结果如下： （1）重组沙门菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)制备及反应原性分析 首先，以优化过密码子的 F 基因 pUC-F-opt 为模板，构建出携带 Flag 标签的pUC-F-opt-Flag，将其与真核表达载体pYA4545连接构建pYA4545-F真核表达质粒。其次，以本实验室构建的质粒 pYA3342-cIL-18 为模板设计引物, 扩增包括原核启动子 Ptrc、cIL-18 片 段 及 终 止 子 TT 的 片 段 Ptrc-cIL18-TT ， 将 其 与 之 前 构 建 好 的pYA4545-pUC-F-opt-Flag质粒连接，构建含有双表达启动子（CMV真核启动子及Ptrc原核启动子）的pYA4545-F-IL18质粒，进而通过WesternBlot和间接免疫荧光的方法确认F蛋白和cIL18蛋白成功表达，且具有良好的免疫原性。将质粒pYA4545-F和pYA4545-F-IL18电转进入延迟裂解型沙门菌载体中获得重组沙门菌 χ11218 （ pYA4545-F ）和 χ11218 （pYA4545-F-IL18） （2）重组沙门菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)免疫保护效果比较与评价 通过免疫保护试验对重组沙门菌的免疫保护效果进行评价。将100只1日龄雏鸡分为5组，每组20只，于第7日、第21日口服接种免疫实验组χ11218（pYA4545）组、χ11218 （pYA4545-F）组和χ11218（pYA4545-F-IL18）组），生理盐水对照组口服等量生理盐水， NDV灭活疫苗组仅在第14天颈部皮下注射免疫。35日龄时，对各组雏鸡进行实验分析，通过流式细胞术检测脾脏和外周血中 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞数量的变化，结果显示重组菌能使 T、B 淋巴细胞增多，产生良好的免疫应答。MTT 法检测免疫后雏鸡法氏囊 B 淋巴细胞增殖能力，结果表明χ11218（pYA4545-F）组和χ11218（pYA4545-F-IL18）组的B淋巴细胞对PMA的刺激有明显的反应性，证明重组菌能提高鸡法氏囊B淋巴细胞的增殖能力。ELISA方法检测血清中NDV抗体含量、IL-4含量、IL-18含量和肠道灌洗液中IgA含量，结果表明重组沙门菌χ11218(pYA4545-F)和 χ11218(pYA4545-F-IL18)能提高血清中NDV抗体、IL-4、IL-18以及肠道灌洗液中IgA含量。同时免疫保护试验结果显示：重组沙门菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)能对基因VII型ND具有一定免疫保护效果。病理切片结果显示χ11218(pYA4545-F)组、χ11218(pYA4545-F-IL18)组虽没有灭活疫苗组保护效果好但与生理盐水组和 χ11218 (pYA4545)组相比胸腺组织和肺组织病理变化较轻。以上结果说明了重组沙门菌具有较好的保护作用，为以延迟裂解性沙门菌作为ND疫苗活载体提供了理论依据，为新城疫DNA疫苗的提供了新思路。