家蚕二分浓核病毒（BmBDV）在报道之初被划分于细小病毒科浓核病毒亚科,而由于其独特的基因组结构,国际病毒分类委员会于2012年将其归类至新设定的二分DNA病毒科二分浓核病毒属,目前BmBDV也是二分DNA病毒科中的唯一成员。家蚕二分浓核病毒能够引起家蚕患浓核症,对家蚕养殖业造成了较大的经济危害。目前该病毒的基因组结构及转录机制已经有了较为全面的报道,但病毒的复制机制、各非结构蛋白功能,以及病毒衣壳的3D结构都尚不明确。研究表明非结构蛋白在病毒的感染及复制周期中起着重要的作用,目前仅对序列相对保守的非结构蛋白NS1的功能有较为详尽的报道,而针对NS2、NS3的研究则较少,鉴于非结构蛋白功能的研究对阐明病毒的复制机理至关重要。本课题以BmBDV的非结构蛋白NS2为研究对象,从蛋白的细胞定位、对各基因启动子活性影响、以及互作蛋白分析三个方面对这一蛋白的功能进行初步的探索。我们首先利用生物信息学软件对包括BmBDV在内的所有已报道的无脊椎动物ssDNA病毒非结构蛋白NS2氨基酸序列进行分析,并建立了系统进化树。系统发生分析表明无脊椎动物ssDNA病毒的NS2在进化分支上与目前的分类较为接近,且同属内的病毒聚集在一支,提示NS2可能在同属内功能较为保守,而BmBDV NS2在进化上靠近Hamapavovirinae亚科。由于BmBDV的NS2蛋白在体外表达时定位于Bm N细胞的细胞核内,且软件分析表明在蛋白的C端存在一个潜在的二分型核定位信号结构域。同时我们也在细胞水平验证了JcDV等其他昆虫ss DNV病毒的NS2蛋白定位,发现均定位于细胞核内,但氨基酸序列中并不具备经典的NLS结构域。因此我们也同时对无脊椎动物ssDNA病毒非结构蛋白NS2的NLS进行了分析,结果表明各病毒的NS2蛋白可能都包含有非经典的NLS结构域,且序列及定位在同一属内较为保守。我们猜测在无脊椎动物ssDNA病毒中NS2蛋白的核定位信号结构域可能有着独特的排列规律,以此保证NS2蛋白在功能上的保守性。基于预测结果,我们构建了重组BmBDV NS2融合e GFP表达载体（p Fastie1-NS2-e GFP）,通过对核定位信号预测区域的截短突变表确认了该潜在NLS结构域的功能性,进而通过单点/多点突变鉴定了NS2的关键氨基酸,结果表明BmBDV的NS2蛋白C端具备一个二分型NLS结构域,而这一NLS的组合规律为:（R）KR（K）X10-12K3/5,X代表任意氨基酸,括号中碱性氨基酸需任留一个。无脊椎动物ssDNA病毒的NS2蛋白在细胞核定位上具有保守性,提示这一蛋白很可能在病毒的复制和转录过程中发挥着重要作用。为了探索NS2蛋白对病毒其他基因在转录过程中是否具有调控作用,我们构建了BmBDV中所有基因的启动子重组质粒以及NS2蛋白过表达质粒,通过荧光素酶表达系统分析启动子质粒单独转染或与NS2表达质粒共同转染Bm N细胞后的荧光素酶活性,分析NS2过表达对病毒各基因启动子活性的影响。结果表明,NS2能够促进NS3的启动子活性并且能够抑制VP的启动子活性,对其他基因的启动子活性没有调控作用。推测NS2可能在感染后期抑制VP的表达并提高NS3的表达,与NS3共同促进病毒粒子的组装及子代病毒粒子的释放。为了筛选宿主细胞中可能与NS2存在互作的蛋白,我们使用杆状病毒表达系统,将BmBDV NS2连接His标签,并构建重组Bacmid（Bacmid-Ie1-e GFPp5.5-NS2-His）,转染细胞后获取了重组杆状病毒,注射家蚕后将患病家蚕的中肠,使用Co-IP及LC-MS/MS技术对NS2的互作蛋白进行了分析后,共得到1088个特异性蛋白,其中一半以上的蛋白都有着两个以上的唯一肽段匹配数。这些特异性蛋白主要包含与免疫相关的载脂蛋白、热激蛋白;在病毒复制方面具功能的翻译延伸因子;在家蚕中肠有消化作用的氨基肽酶;以及在浓核病毒VP含有的介导病毒进入细胞的磷脂酶A2。同时我们在互作蛋白中也发现了某些具核转运功能的蛋白,提示后续可从NS2功能与核转运蛋白的相互关系出发研究NS2在病毒入核和出核转运中的功能。综上所述,我们对BmBDV NS2的功能进行了初步研究。研究表明NS2定位在细胞核内,且具有独特的核定位信号,该蛋白可能在病毒基因复制中发挥作用;NS2可能具有调控NS3及VP启动子活性的功能;同时,我们初步分析了NS2在家蚕中肠中的互作蛋白。这些对BmBDV的NS2蛋白功能的初探结果对进一步的深入研究提供了数据支持,同时也对全面解析该病毒的复制机制奠定了理论基础。