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研究背景及目的PLOD2基因编码赖氨酸羟化酶2（LH2）,主要影响细胞外基质中胶原纤维的形态、结构、分子交联,其在宫颈癌、乳腺癌、肺癌等多个癌种中高表达,导致细胞外基质的硬度增加,与肿瘤的侵袭转移密切相关。已有研究表明,恶性肿瘤的侵袭转移与肿瘤微环境息息相关,细胞外基质重构是肿瘤侵袭转移过程中的关键事件,肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）作为细胞外基质中胶原纤维的主要来源,在这个过程中扮演了重要角色。目前研究认为CAFs可来源于肿瘤基质中正常的成纤维细胞（NFs）等细胞,基质僵硬等环境刺激可诱导正常成纤维细胞转化为CAFs。但迄今宫颈癌相关成纤维细胞的来源仍不清楚。本课题组前期研究表明,PLOD2在宫颈癌中高表达,脉管癌栓、深肌层浸润、盆腔淋巴结转移、患者不良预后成正相关,PLOD2高表达者侵袭性更强,但其具体作用机制尚不明确。本研究拟初步探究宫颈癌细胞中PLOD2基因是否促进NFs向CAFs转化以创造良好的肿瘤微环境,导致增强肿瘤的侵袭转移,从而为针对性地减少宫颈癌相关成纤维细胞的产生,破坏肿瘤微环境的完整性,削弱其侵袭转移能力提供新的理论依据和治疗靶点。研究方法1、采用慢病毒转染技术,使宫颈癌HeLa细胞（腺癌）和SiHa细胞（鳞癌）过表达PLOD2,运用qRT-PCR、Western blot实验检测PLOD2过表达效果,构建稳定过表达PLOD2基因的宫颈癌细胞株。2、利用Transwell小室分别将HeLa、SiHa细胞与正常成纤维细胞（HFF-1细胞）共培养:HeLa或SiHa细胞接种于Transwell小室内（上室）,成纤维细胞接种于与小室配套的细胞培养板内（下室）;实验分组为:接种成纤维细胞于细胞培养板内,其对应的Transwell小室内不接种宫颈癌细胞,为BLANK组;转染阴性对照病毒的宫颈癌细胞与成纤维细胞共培养分别为HeLa-LV-NC组、SiHa-LV-NC组;过表达PLOD2的宫颈癌细胞与成纤维细胞共培养分别为HeLa-LV-PLOD2 组、S i Ha-LV-PLOD2 组;3、两种细胞共培养48h后,观察成纤维细胞形态变化;收集下室成纤维细胞进行划痕实验检测其迁移能力;通过qRT-PCR、Western blot检测成纤维细胞中CAFs标志物α-SMA、FAP-α、FSP1和PLOD2的表达量;收集上室宫颈癌细胞,通过Transwell实验、划痕实验检测宫颈癌细胞的迁移侵袭能力;收集共培养体系培养液,采用ELISA法检测培养液中转移相关细胞因子VEGF、MMP9的含量。研究结果1、进行慢病毒转染后,在倒置荧光显微镜下观察SiHa和HeLa细胞可见清晰绿色荧光,qRT-PCR及Western blot实验结果证实转染过表达PLOD2慢病毒后宫颈癌细胞中PLOD2在基因水平和蛋白水平表达均明显上调,即成功构建稳定过表达PLOD2的宫颈癌细胞株。2、共培养后,BLANK组的成纤维细胞形状和大小基本保持一致,呈长梭形,排列呈现出一定的方向性。而LV-NC组和LV-PLOD2组的成纤维细胞大小以及形状外观表现显著不一,边缘出现较多突起,排列不规则,细胞之间出现重叠生长的现象,表现出CAFs的形态特征。划痕实验提示共培养后的成纤维细胞的迁移能力增强。表明PLOD2促进宫颈癌细胞诱导成纤维细胞获得CAFs的形态特征及迁移特性。3、共培养后,qRT-PCR及Western blot实验结果显示成纤维细胞中CAFs标志物α-SMA、FAP-α和FSP1表达量均较BLANK组明显升高,且LV-PLOD2组中的表达量高于LV-NC组;而LV-NC组PLOD2表达量与BLANK组相比无明显差异,LV-PLOD2组PLOD2表达较LV-NC组升高,表明PLOD2促进宫颈癌细胞诱导成纤维细胞表达CAFs标志物,即向CAFs转化,且成纤维细胞PLOD2表达升高。4、共培养后LV-NC组、LV-PLOD2组培养液中MMP9和VEGF含量明显高于BLANK组,且LV-PLOD2组中的表达量显著高于LV-NC组。表明PLOD2促进宫颈癌细胞诱导成纤维细胞向CAFs转化,可增加转移相关细胞因子的分泌。5、共培养后宫颈癌细胞划痕实验显示LV-PLOD2组的宫颈癌细胞划痕面积愈合的百分比明显大于LV-NC组,Transwell实验结果显示LV-PLOD2组中癌细胞从上室穿过小室膜的细胞数明显高于LV-NC组,表明成纤维细胞向CAFs转化后可作用于宫颈癌细胞,使其迁移能力增强6、共培养后宫颈癌细胞Transwell侵袭实验显示LV-PLOD2组中癌细胞从上室穿过小室膜的细胞数明显高于LV-NC组,表明成纤维细胞向CAFs转化后可作用于宫颈癌细胞,使其迁移能力增强。研究结论1、PLOD2促进宫颈癌细胞诱导正常成纤维细胞（NFs）转化为肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）。2、PLOD2促进宫颈癌细胞诱导正常成纤维细胞向CAFs转化可增加转移相关细胞因子的分泌。3、成纤维细胞向CAFs转化后可作用于宫颈癌细胞,使其迁移侵袭能力增强。4、我们的研究提示,PLOD2可通过促进宫颈癌相关成纤维细胞的转化以创造良好的肿瘤微环境,加速宫颈癌的侵袭转移。