研究背景与目的：成纤维细胞(fibroblasts)是创面修复中重要的细胞,主要来源于结缔组织,可合成及分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质等机能。肌成纤维细胞(myofibroblast)是一种来源于成纤维细胞的高度分化型细胞。它的功能是产生力量和改变组织张力,在伤口愈合或纤维化器官的细胞外基质中主要负责组织收缩。这些具有收缩特点的细胞可以上调细胞外基质蛋白比如Ⅰ型胶原(Collagen I),并且高度表达α-平滑肌肌动蛋白(aSMA)。在生理情况下,这是创伤愈合的可靠标志,也是创面愈合过程中结缔组织重塑和纤维化形成的关键。然而病理情况下,比如创面较大或存在异常的炎症反应时,肌成纤维细胞分化不受控制,持续存在则会引起创面的过度收缩导致增生性瘢痕,如发生在关节等活动部位则极易导致瘢痕挛缩,严重影响了患者的生活质量。更有文献表明它的存在与器官纤维化,促进肿瘤生长也有直接关系。间充质干细胞(MSCs)基于其较高的诱导增殖分化潜能,被广泛应用于组织损伤修复领域。然而仍存在细胞来源匮乏,传代后增殖分化潜能明显下降,与其提取、制备等成本相比效果并不显著,使得推广陷入瓶颈。这就要求人们从新的视角,进一步阐明MSCs作用于创面修复的机制,以便为改良优化干细胞的治疗策略提供新靶点。外泌体(Exosome)作为旁分泌的一个重要组成部分,是由各种活体细胞分泌的大小约为50-150nm膜性囊泡,与质膜融合后,以胞吐形式释放入胞外环境中。当外泌体和靶细胞接触后,外泌体及其携带的生物分子以胞吞的形式被接收并发挥作用。在外泌体所携带的生物分子中,微小非编码RNA (miRNAs)因其在基因表达调控上具有重要作用而受到广泛关注。最新研究证实,供体细胞的miRNAs可以通过外泌体转运的形式被靶细胞接收,并在其内“重编程”相关的靶基因。此外外泌体还提供了保护作用,可使其携带的miRNAs在高温、酸碱、反复冻融等恶劣环境条件下保持稳定。这种miRNAs在生物体内定向转运与保护机制的发现,开辟了miRNAs研究领域的新篇章,结合外泌体精准且高效的作用机制和易于保存和调控的结构特点,使得Exosome-miRNAs的靶向治疗具备极高的商品化潜能和转化应用前景。现阶段对于MSCs外泌体的研究在国内外方兴未艾。鉴于MSCs可以用于大创面组织缺损的修复,可以加快创面的愈合并且减轻瘢痕的形成,而外泌体是含其细胞内来源活性物质的微囊泡,我们推测外泌体是MSCs在创面修复的细胞治疗中的重要媒介,而外泌体介导的miRNAs转运可能在此过程中的某些阶段发挥重要作用。本课题主要研究了以下内容：第一部分脐带间充质干细胞来源的外泌体抽提与鉴定实验方法：用分次超速离心法加过滤法分离外泌体。通过逐渐增加离心力度将细胞、细胞碎片以及较大的颗粒依次去除,然后用孔径为200μm的滤膜过滤一次,最后至少2小时,并且以100000×g的超速离心速度将外泌体沉淀出。运用Western Blot、 BCA、Nanosight等技术鉴定抽提的外泌体是否纯净。实验结果：Western blot结果显示外泌体的标记性蛋白CD63、CD81表达量显著升高;Nanosight显示外泌体直径分布于100nm左右,并且浓度在2000μg/ml。第二部分 脐带间充质干细胞来源的外泌体对成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的作用实验方法：首先构建小鼠背部皮肤全层创面缺损模型,将实验分为脐带间充质干细胞组(uMSC组)、脐带间充质干细胞外泌体组(uMSC-Exo)、PBS组、无处理组。通过第7、14、21日测量创面面积以及免疫组化检测αSMA表达量验证脐带间充质干细胞对于创面的修复速度以及肌成纤维细胞的含量；其次通过用TGFβ诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,并在此过程中干预uMSC-Exo,收集细胞后通过qRT-PCR、 Western Blot、流式抗体细胞检测uMSC-Exo对肌成纤维细胞标志性蛋白αSMA的表达量变化。并运用划痕以及细胞周期实验检测成纤维细胞增殖能力的区别。实验结果：体内动物模型显示uMSC组与uMSC-Exo组对于创面愈合速度没有统计学差异,并且肌成纤维细胞的含量也基本一致。这说明uMSC-Exo可以发挥干细胞样的功能,并且与其相来源的干细胞功能基本没有差别。从体外的细胞模型中,qRT-PCR与Western Blot都检测出uMSC-Exo可以减少αSMA以及Collagen Ⅰ的表达；并且划痕和流式细胞周期实验证明uMSC-Exo可以加快成纤维细胞的迁移与增殖能力。第三部分外泌体的成分鉴定及各成分对成纤维细胞增殖分化的作用实验方法：通过蛋白质酶或核酸酶的裂解,将外泌体中蛋白质或核酸成分去除,使其成为去蛋白质外泌体(uMSC-Exo-PROnase)或者去核酸外泌体(uMSC-Exo-RNAse),并通过细胞周期检测这两者对成纤维细胞增殖能力的差异；通过Western Blot以及qRT-PCR检测两组对肌成纤维细胞分化αSMA蛋白表达水平的差异,以及通过3D胶原回缩验证这两者对于肌成纤维细胞收缩能力的区别。实验结果：凝胶电泳显示蛋白酶消化后的uMSC-Exo中只剩下核酸成分,并且大部分<100bp,这说明uMSC-Exo中的核酸大部分为microRNA。随后采用Western Blot以及qRT-PCR等技术证明出uMSC-Exo-PROnase干预细胞模型后,αSMA表达量显著降低,而uMSC-Exo-RNAse的αSMA则未有明显变化。这说明uMSC-Exo中的microRNA成分主要可以抑制肌成纤维细胞的分化；而细胞周期实验中显示uMSC-Exo-RNAse组相较于uMSC-Exo-PROnase组细胞活力明显增快,这说明uMSC-Exo可能是通过其中的蛋白成分加速了对成纤维细胞增殖的能力。这也很好的证明了第一部分的体内实验即uMSC-Exo可以加快创面的愈合也可以减轻瘢痕的现象。第四部分脐带间充质干细胞外泌体中miRNA的检测及通路预测实验方法：通过高通量测序,以HEK293细胞的外泌体为对照,全面检测uMSC-Exo中miRNA的含量及丰度。利用现有的GEO数据(gse46989和gse56862)分析uMSC以及HEK293细胞的miRNA丰度。依据课题设计筛选在肌成纤维细胞分化调控中发挥重要作用的mRNA作为候选靶基因,并通过TargetScan、GO、Pathway等预测软件预测了特异性microRNA可能对靶基因发挥作用的通路,并应用包括qRT-PCR、Western Blot实验辅以验证。实验结果：高通量测序显示uMSC-Exo丰度排名前十的miRNA分别为miR-21-5p、miR-125-5p、miR-23-3p、miR-100-5p、let-7f-5p、let-7a-5p、miR-145-5p、 miR-1260b、miR-1260a、miR-199a-3p。与现有的GEO数据作对照发现除了miR-21-5p,其余含量在uMSC细胞中本身比较少,这说明uMSC是一个主动分泌miRNA的形式,而非被动形式。随后通过GO、Pathway对靶基因及通路的预测,发现其中miR-21-5p、 miR-125-5p、miR-23-3p、miR-145-5p都靶向了对肌成纤维细胞生成有重要作用的SMAD2、TGFβ2以及TGFβR2而且调控了TGFβ2/SMAD2这一信息通路。第五部分脐带间充质干细胞来源的外泌体中miRNA对肌成纤维细胞分化的机制研究实验方法：首先我们通过构建的TGFβ2, TGFβR2以及SMAD2的3’UTR的质粒与预测得到并挑选出来的miR-21-5p、miR-125-5p、miR-23-3p、miR-145-5p的过表达mimics进行双荧光素酶报告基因。并通过qRT-PCR、Western Blot检测在uMSC-Exo中过表达或抑制特异性miRNAs后,下游的靶基因αSMA以及通路中β-SMAD2的磷酸化活性：最后在动物模型上通过荧光原位杂交技术定位uMSC-Exo中miR-21-5p、 miR-125-5p、miR-23-3p、miR-145-5p的分布情况以及其对p-SMAD2的活化情况。实验结果：双荧光素酶报告基因显示miR-21-5p、miR-125-5p、miR-23-3p、 miR-145-5p都可以直接与TGFβ2, TGFβR2或SMAD2的3’UTR端相结合,说明miRNAs可以直接这些蛋白的翻译水平。qRT-PCR以及Western Blot显示过表达miRNAs后,SMAD2, αSMA的表达量均发生下调；而抑制这些miRNAs后,靶基因则与对照组无统计学差异。这些说明miR-21-5p、miR-125-5p、miR-23-3p、miR-145-5p可以通过抑制TGFβ2,TGFβR2以及SMAD2引起αSMA的下调。体内原位杂交实验证明uMSCs-Exo在注射入创面四周皮下后,miRNA主要分布于皮下细胞的胞核周围,并且可以抑制p-SMAD2的活性从而导致肌成纤维细胞分化减少。但对创面的愈合速度不受影响。