非肌细胞肌球蛋白重链ⅡA亚型在乳腺癌转移中的作用

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恶性肿瘤(malignant tumor)严重的危害人类健康与生命,近二十几年来,我国恶性肿瘤死亡率上升了29.42%,并且更趋于年轻化,已列居各类死因之首。乳腺癌(mammary carcinoma)是人类常见的一种恶性肿瘤,也是女性主要恶性肿瘤之一。乳腺癌的转移和复发是患者治疗失败和死亡的主要原因。即肿瘤细胞的侵袭能力和转移能力是治疗肿瘤的一大障碍。而肿瘤的侵袭和转移则主要是细胞运动力改变的结果,细胞的运动力主要由肌动蛋白和肌球蛋白相互调节进行的[1],这一过程由细胞骨架系统和肌球蛋白启动因子调控,因此肌球蛋白(Myosin)逐渐成为研究的热点。非肌细胞肌球蛋白Ⅱ(Nonmuscle myosin Ⅱ, NMⅡ)是细胞骨架的组成成分,并与肌动蛋白相互作用参与细胞极性的产生、细胞迁移、细胞粘附这三个过程,而此过程即为肿瘤转移的起始阶段,因此推断NMⅡ在肿瘤转移过程中具有重要作用。肌球蛋白Ⅱ是由两条重链(NMHC,230kDa)及两对轻链(NMLC17、NMLC20)组成的六聚体结构[4,5]。NMLC起调节和稳定作用,NMHC决定细胞运动力,因而肿瘤转移细胞运动中起关键作用的很可能是NMHCⅡ。在哺乳动物中, NMHCⅡ包含三种亚型,分别为NMHCⅡA,NMHCⅡB和NMHCⅡC,是由3种不同基因(Myh9,Myh10和Myh14)编码[9]。其中NMHCⅡA作为一种产力蛋白而参与细胞的迁移。本研究通过沉默人乳腺癌细胞系MCF-7中NMHCⅡA的基因观察NMHCⅡA对乳腺癌MCF-7细胞生长,粘附,侵袭能力的影响。目的:通过RNA干涉沉默乳腺癌MCF-7细胞的NMHCⅡA基因,观察NMHCⅡA对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:采用RNAi技术沉默MCF-7细胞的NMHCⅡA基因,利用免疫细胞化学染色和Western Blot方法检测NMHCⅡA沉默情况;而后应用CCK-8试剂盒检测NMHCⅡA基因对MCF-7细胞增殖的影响;通过细胞划痕实验,Boyden体外重组基底膜侵袭试验,MMP-9细胞免疫细胞化学染色和细胞骨架免疫荧光染色来检测NMHCⅡA对MCF-7细胞侵袭能力的影响。实验以空质粒组为阳性对照,以未转染组为阴性对照。结果:1. NMHCⅡA免疫细胞化学染色和Western Blot方法均证实瞬时转染成功,免疫荧光观察计数发现转染效率可达80%。2. CCK-8试剂盒检测结果显示,各组MCF-7细胞的生长情况一致。3.细胞划痕结果显示,NMHCⅡA基因RNAi技术沉默MCF-7细胞组体外运动和迁移能力要比空质粒组和未转染组细胞弱。4. Boyden体外重组基底膜侵袭试验结果显示,RNAi技术沉默MCF-7细胞NMHCⅡA基因组的侵袭深度和穿过人工基底膜的细胞数都远远小于空质粒组和未转染组。5.免疫组织化学染色结果显示RNAi技术沉默MCF-7细胞NMHCⅡA基因组MMP-9表达较弱于空质粒组和未转染组(P<0.001)。6. Tublin免疫荧光染色结果显示RNAi技术沉默MCF-7细胞NMHCⅡA基因组细胞骨架排列紊乱,有的骨架缺失,而空质粒组和未转染组细胞骨架较正常结论:1. RNAi技术沉默MCF-7细胞NMHCⅡA基因对细胞生长增殖能力无影响。2. RNAi技术沉默MCF-7细胞NMHCⅡA基因可导致细胞迁移、侵袭能力降低。3. NMHCⅡA通过改变细胞骨架结构和MMP9的合成能力从而调节肿瘤迁移、侵袭,与肿瘤转移密切相关。
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