【摘 要】
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A型流感病毒RNA聚合酶是由PB1,PB2和PA三个亚基组成:PB1是聚合酶的核心亚基,它能特异性识别并结合vRNA的5‘帽子和3’Poly A结构。其核酸内切酶活性可以切割宿主mRNA的5‘帽
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A型流感病毒RNA聚合酶是由PB1,PB2和PA三个亚基组成:PB1是聚合酶的核心亚基,它能特异性识别并结合vRNA的5‘帽子和3’Poly A结构。其核酸内切酶活性可以切割宿主mRNA的5‘帽子结构作为病毒基因组转录的引物,催化RNA链的延伸;PB2亚基是多功能碱性蛋白,在病毒基因组转录时,参与识别招募宿主mRNA的5端帽子结构作为转录的引物;PA是一种磷酸化蛋白,它可以通过激活泛素化途径诱导蛋白水解,降低自身蛋白和与其共表达的异源蛋白质的累积水平。研究表明PA具有维持聚合酶复制酶活性和转录酶活性的双重功能。本课题构建了PAN蛋白的原核表达载体pGEX-6p-1-PAN,在大肠杆菌表达系统中大量可溶性表达,通过亲和层析和Superdex -G200纯化后,获得了纯度95%以上的目的蛋白;运用气相扩散悬滴法进行PAN晶体的生长,首先用HamptonResearch公司Crystal screen Kit Index,ScreenⅠ和ScreenⅡ进行结晶条件初筛,并对初筛得到ScreenⅠ18条件通过拉沉淀剂、PH梯度的方法进行优化,最终在0.1mol/l MES pH6.5,PEG8000 25%(w/v),0.1mol/l MgCl2条件下获得了可用于数据收集的晶体,分辨率为3.2(?)。用HKL2000软件包对衍射数据进行处理,得到PA256蛋白晶体的space group为P1空间群;晶胞参数为:a=97(?),b=64(?),c=57(?):每个不对称单位有三个蛋白分子:溶剂含量为:32.5%。
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