大豆[Glycine max (L.) Merr.]起源于我国,至今已有五千年的栽培历史,是世界上重要的粮食和油料作物之一。异黄酮是大豆中重要的多酚类次级代谢产物。对植物而言,异黄酮作为色素吸引昆虫传播花粉和种子,并且具有清除紫外线对植物造成的DNA突变等作用。对人类健康而言,异黄酮具有抗氧化、调节心血管系统、抗癌、防癌等作用,对人体保健有多种功效,故而愈来愈受到人类的高度关注。查尔酮还原酶(chalcone reductase, CHR)是豆科植物中的一种参与异黄酮代谢的还原酶。它与查尔酮合酶共同催化香豆辅酶A (coumaroyl-CoA),生成6-脱氧查尔酮。6-脱氧查尔酮作为异黄酮代谢的中间产物参与随后的生化反应。由于查尔酮还原酶是豆科植物中特有的一个还原酶,对于它的研究报道比较少,因此克隆查尔酮还原酶基因并研究其功能,有助于进一步了解大豆中异黄酮代谢过程。转基因植物是验证基因功能的基础,因此,本试验在克隆、通过生物信息学分析查尔酮还原酶的同时,还对农杆菌介导大豆子叶节转化体系进行了尝试,初步得到一些转基因大豆植株,并对如何优化该转化体系进行了分析。南农1138-2是长江中下游地区的大豆栽培品种,其籽粒异黄酮含量中等偏高,约4610μg/g。本研究以栽培大豆南农1138-2叶的mRNA为模板,采用RT-PCR方法,克隆获得cDNA全长序列GmCHR.通过BioXM2.6生物信息学分析表明,该序列位于第14号染色体,GmCHR全长为1031bp,含有3个外显子和2个内含子,编码315个氨基酸,蛋白质分子量为35489.8Da,等电点为6.32。对GmCHR基因及编码的氨基酸序列与百脉根(Lotus japonicus)、甘草(Glycyrrhiza glabra)、葛根(Pueraria montana)、黄芪(Astragalus mongholicus)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和紫花苜蓿(M.sativa)中的同源基因进行了比对,绘制了进化树。GmCHR核苷酸序列和预测的氨基酸序列与其他豆科植物的查尔酮还原酶高度相似。组织表达分析表明,在自然生长状态下GmCHR在叶中的表达量最大；其次是种子；在花和茎中相同；在根中的表达量最小。表达量排序为叶>种子>茎≈花>根。其次,仍然选用南农1138-2,利用Gateway方法,设计了含有attB位点的一对特异性引物,进行GmCHR基因的BP反应,其阳性克隆检测谱图表明GmCHR基因已插入载体,测序结果与原序列相符,证明片段正确,得到入门载体pDKNR221-GmCHR。进行GmCHR基因LR反应,获得植物过表达载体pMDC83-GmCHR,经阳性克隆检测,表明过表达载体已成功转化农杆菌EHA105.在克隆GmCHR的同时,利用已构建好的大豆丙二烯氧化物合酶基因(allene oxide synthase, AOS, EC.4.2.1.92)植物过表达载体pMDC83-GmAOS,运用农杆菌介导子叶节法对Jack、大粒黄、猴子毛、台湾75、Williams、常熟散子黄豆和南农88-31(简称88-31)等7个大豆品种进行转化得到T0代组培苗6株,其中三株结有豆荚,待T1代检测。同时考察了影响大豆转化率中的两个因素,即氯气熏蒸灭菌时间对种子的萌发率和组培中的污染率的影响,以及不同品种大豆的再生率比较。研究发现,(1)灭菌时间和基因型对种子萌发率影响较大。灭菌时间过长将影响种子的萌发率。猴子毛的萌发率在测试品种中的萌发率最高,为95%,大粒黄其次,为77%,Jack为74%,南农88-31为64%,Williams为58%；(2)灭菌时间与污染率的关系：在种子清洁的情况下,灭菌7小时即可达到污染率≤5%；(3)对7个品种的再生率统计结果表明,按照其高低排序,依次为大粒黄>猴子毛>Jack>常熟散子黄豆>88-31>Williams>台湾75。大粒黄的再生率达到89.51%。若按再生率每降低10个百分点降低1个级别分类,则大粒黄和猴子毛为2级,Jack和常熟散子黄豆为3级,88-31和Williams为4级,台湾75为6级。