心磷脂是线粒体独有的一种磷脂成分，是线粒体保持形态完整、进行氧化磷酸化和高效产生ATP的必需分子之一。在糖尿病，肥胖病及一系列的代谢综合症中，线粒体形态改变和功能障碍往往伴随病理性心磷脂缺失及心磷脂支链的改变。因此，研究参与心磷脂代谢的酰基转移酶造成线粒体功能紊乱相关机制，将对疾病发展过程的认识提供新的试验和理论依据，并为其治疗提供可能的靶标和效应分子。本研究主要探讨参与病理性心磷脂重塑过程的心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)，在体内和体外如何影响线粒体的形态及其功能，以及该过程中涉及的相关机制。本研究结果表明，氧化应激反应可以诱导ALCAT1基因的表达。高表达ALCAT1后引起心磷脂含量下降、支链种类变化、引起线粒体形态改变、对氧化损伤的敏感程度上升、继而造成线粒体功能受损，产生更多的活性氧化物质。相反，ALCAT1缺失后细胞内的氧化物质显著降低，线粒体DNA含量增多，突变减少。因此，该酶可能通过改变心磷脂含量及酰基支链这一过程，参与调节能量代谢和细胞凋亡等重要事件。由于心磷脂及氧化应激反应在一系列代谢性疾病的发生和发展过程中起到十分关键的作用，该发现对研究线粒体功能障碍与代谢紊乱的相互关系方面有着重要的指导意义。本论文分三个研究部分。1. ALCAT1基因调控线粒体形态及功能。将含ALCAT1基因克隆的序列导入p-BABEpuro逆转录表达载体，通过病毒感染和抗生素筛选获得高表达ALCAT1的C2C12细胞株；并通过基因打靶获得ALCAT1基因敲缺小鼠，在体内和体外研究ALCAT1基因对线粒体的形态及功能的影响。利用共聚焦显微镜和电镜技术，检测高表达ALCAT1对线粒体形态的影响，发现ALCAT1诱导线粒体发生断裂和肿胀，而非正常的管网状结构；同时内质网扩张膨胀，线粒体和内质网间距显著增大。qRT-PCR技术分析显示，ALCAT1高表达后引起mtDNA相对拷贝数下降，mtDNA随机点突变升高。而从ALCAT1基因敲除小鼠的MEFs上得到的结果则正好相反。利用Westernblot技术分析显示，ALCAT1高表达后引起线粒体蛋白prohibitin缺失，线粒体复合体I、II、III、V的蛋白表达都有明显降低。最后，发现高表达ALCAT1的细胞心磷脂含量降低，其中优势支链C18:2和C18:1减少了40%左右。2.氧化应激与ALCAT1的相互调节。应用qRT-PCR方法检测ALCAT1高表达细胞中各种氧化酶及还原酶的表达水平，结果显示高表达ALCAT1后，氧化酶如NADPH氧化酶4、NADPH醌氧化还原酶1等表达显著升高，还原酶如谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氧还蛋白、硫氧还原蛋白还原酶等表达降低；检测ALCAT1敲除小鼠各组织中丙二醛水平，发现ALCAT1敲除后，小鼠肝脏的脂类过氧化水平显著降低。用双氧水分别处理高表达ALCAT1细胞和正常C2C12细胞，前者线粒体产生的氧化型物质DCF和MDA均是后者的2倍；而mtDNA的缺损程度，前者是后者的2倍。同时，还发现如双氧水、叔丁基-氢过氧化物等氧化信号可以诱导ALCAT1基因的mRNA水平上升。在小鼠上饲喂高脂食物刺激活性氧化物质产生，也能诱导ALCAT1基因在心脏、肝脏和肌肉组织中mRNA表达水平上调。3.线粒体融合蛋白2(MFN2)是调节ALCAT1功能的重要因子。利用qRT-PCR和Western Blot检测，发现ALCAT1高表达引起线粒体融合相关蛋白MFN1，MFN2和OPA1mRNA水平降低，蛋白水平上MFN1和MFN2有显著下降。ALCAT1基因敲除后，蛋白水平上，只有MFN2表达显著升高。利用线粒体融合实验，发现高表达ALCAT1后引起线粒体融合障碍，其主要原因之一是MFN2表达下调。通过瞬时转染三种融合相关蛋白的表达质粒，发现MFN1和MFN2的重新表达可以恢复线粒体的形态，而OPA1不起作用。转染MFN2表达质粒后，通过对线粒体耗氧速率的检测，发现MFN2可以修复ALCAT1高表达引起的ComplexI及ComplexV的呼吸功能障碍。证明MFN2是ALCAT1的下游基因。最后，Western Blot检测氧化应激同MFN2的关系，发现ROS处理细胞后，MFN2的表达降低，而用抗氧化剂DPI预先处理细胞则可以缓解MFN2的降低。该结果揭示了ROS产生与MFN2表达相互拮抗的关系。