论文部分内容阅读
高等植物的生殖发育是一个非常复杂且精妙的过程,探索其生长发育特征及分子调控机制具有重要的科学研究价值。拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为典型的模式植物,具备生长周期短、基因组小、基因背景清楚、基因高度纯合且易获得各种缺陷表型突变体等优势,成为研究植物生长发育规律及分子调控机制的理想材料。本研究以胚胎和胚乳发育异常的4个突变体（275-3、350、535-1和578-1）以及1个雄性不育突变体（241-2）为实验材料,通过拟南芥两个不同生态型的杂交获得突变体的分离群体,利用图位克隆技术,经过初步定位、精细定位确定目的基因所在染色体及区间范围,结合基因组重测序分析,寻找发生突变、导致突变体表型的目的基因。同时,还运用胚珠透明、胚乳自发荧光、花粉I2-KI染色、花药FDA染色、花药亚历山大染色、花药半薄切片等实验方法对突变体的表型进行观察。本研究获得的主要实验结果如下:1、对突变体275-3、350、535-1和578-1进行胚珠透明及胚乳自发荧光观察,结果显示:当野生型胚胎发育到球形时期,突变体275-3的胚胎已开始发育迟缓,但仍会继续生长,到球形期停滞;275-3的胚乳游离核减少,且未细胞化。当野生型胚胎发育到球形时期,突变体350胚胎虽也处于球形期,但分裂面紊乱;当野生型胚胎发育到鱼雷期时,突变体350胚胎发育停滞于中球形至晚球形时期,分裂面不规则。与野生型相比,突变体350胚乳核减少、膨大,且未细胞化。当野生型胚胎处于早心形期时,突变体535-1胚胎便开始出现异常,仅发育至8细胞至16细胞时期;535-1胚胎发育最终停滞于早球形期,且胚胎分裂面紊乱,胚体与胚柄界限模糊。当野生型胚胎发育至球形时期,突变体578-1胚胎处于两细胞时期,且在球形期之前发育停滞,胚胎分裂面紊乱,胚柄发育异常。突变体535-1和578-1均胚乳核稀少、膨大且以合胞体形式存在,并未观察到胚乳细胞化。2、初步观察突变体241-2的表型,发现241-2角果短小且不产生种子。对其花粉和花药进行染色观察,结果显示,该突变体花粉败育,花药和雄配子体发育异常。进一步的半薄切片观察表明,突变体241-2的花粉在小孢子母细胞及四分体时期基本正常,但在单核靠边期小孢子高度液泡化、异常膨大,二核花粉时期依然形状异常、数目减少,最终皱缩凹陷、降解成组织碎片。因此,突变体241-2的花粉在四分体到单核靠边期之间就已开始败育。3、运用遗传学、分子生物学等研究手段,分析突变体275-3的表型和遗传稳定性,结果显示突变体275-3胚胎、胚乳败育的表型在杂交、回交的过程中可以稳定遗传,胚珠败育率约为25%,后代表型分离比接近2:1,由此判断275-3应当是由单基因控制的隐性突变,并且纯合致死。在突变体275-3、350、535-1和578-1的图位克隆工作中,将杂交和回交获得的BC2F1代群体用于初步定位分析,BC3F1代群体用于精细定位及基因组重测序;在突变体241-2的图位克隆工作中,取F2代用于基因组重测序分析。图位克隆结果如下:（1）突变体275-3的突变位点位于第2号染色体的分子标记T22F11与T9J22之间,即Chr02:10779026～11328569,其间的物理距离为549543bp。在基因组重测序分析中,发现在Chr02:11104201后存在一个碱基C的插入,并且通过对该位点前后扩增进行片段测序,也确认在此处确实发生了突变。将该位点对应的At2g26060作为候选基因,同时在NCBI上搜索,发现At2g26060基因名称为At CIA1,检索文献发现已有相关功能研究的报道,且突变体275-3与文献中所用突变体的表型一致。（2）突变体350的突变位点定位于第3号染色体的分子标记MGL6与MKP6之间,即Chr03:5634662～6014083,物理距离为379421bp。重测序分析发现在Chr03:5727293-5727329之间发生了37个碱基的缺失,对应的基因为At3g16810,并将其列为候选基因。在NCBI上搜索发现At3g16810基因名称为APUM24,检索文献发现已有关于该基因功能研究的报道,且突变体350与文献中报道的突变体表型一致。（3）突变体535-1突变位点定位于第2号染色体分子标记In Del 2与In Del 3之间,即Chr02:17446704～17574439,物理距离大小为127735bp。经过基因组重测序分析,在该区间内并未找到可能的突变位点。（4）突变体578-1突变位点定位于第2号染色体的分子标记Indel 1与Indel 2之间,即Chr02:17240191～17446704,物理距离为206513bp。经过基因组重测序分析,在该区间内并未找到可能的突变位点。（5）对于突变体241-2,基因组重测序结果发现,在Chr04:11384008处存在单个碱基G的缺失;在Chr04:11384015处碱基A突变成G;在Chr04:11384018后有单个碱基T的插入,这3个位点非常接近,对应的基因为At4g21370。对候选位点前后的片段进行扩增,却无法扩增得到目的条带,因此未能验证重测序的结果。