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盐酸克伦特罗(Clenbuterol,CL),是一种人工合成的β2-肾上腺素受体激动剂,与莱克多巴胺、沙丁胺醇等药物统称为“瘦肉精”。最初作为临床上支气管扩张剂使用,防治支气管哮喘、慢性支气管炎等疾病,但由于其副作用较大而停止使用。CL具有改变肉畜体内营养物质重新分配的功能,减少脂肪的合成与积累,加快蛋白质的合成速度,从而改变畜肉品质。然而,肉畜食用高剂量的CL后会产生大量的残留,食用残留有CL的动物源性食品会对人体产生毒副作用,影响人体健康。因此,世界各国明令禁止将CL作为饲料添加剂使用,我国农业部也严令禁止使用。然而国内仍有非法者将之大量用于肉畜生产以牟取暴利。目前国内外已建立多种方法检测CL的残留,包括仪器分析法,如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GS)、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS);免疫学分析方法,如酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫测定法(CGIA)等。虽然色谱技术能准确、高效的检测CL的残留,但存在方法复杂、耗时长、技术要求高等问题且需要昂贵的仪器、专业的操作技能,不适合大批量样品的筛选。而ELISA方法可以解决这些问题,它是一种简单、准确、高效、廉价、特异的检测方法,适于大批量样品的快速筛选。本研究以单克隆抗体和酶联免疫吸附测定技术为基础,通过蛋白质连接技术合成CL人工抗原,研制出针对CL的单克隆抗体,建立检测CL残留的CiELISA检测方法。1.CL人工抗原的合成与鉴定。通过重氮法将CL与载体蛋白(BSA、OVA)偶联,合成人工抗原CL-BSA、CL-OVA,通过紫外扫描和免疫学方法初步鉴定偶联成功。两种抗原CL-BSA、CL-OVA的结合比例分别为12：1和10：1。2.CL单抗的制备。通过对比实验,将CL-BSA作为免疫原,CL-OVA作为包被原。用CL-BSA常规免疫BALB/c小鼠,五免后血清效价达1：16000以上。通过杂交瘤技术和酶联免疫技术最后筛选获得3株能稳定分泌抗CL特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中一株细胞8D2分泌的抗体对CL的表现出较强的结合能力,制备的腹水效价为1：120000,蛋白浓度为21.8mg/mL3.ELISA检测方法的建立。利用8D2杂交瘤细胞制备的抗CL腹水建立检测CL残留的间接竞争ELISA方法。采用包被原最佳稀释浓度1：10000,腹水抗体的工作浓度1：60000,药物浓度在0.5～50ng/mL范围内得到标准曲线线性方程为：y=-0.5015x+0.7438,相关系数R2=0.9919,IC50为2.15ng/mL,检测限低于0.5ng/mL,定量限为0.97ng/mL。交叉实验表明,该单抗对CL表现出高度的特异性,与其他一些β-肾上腺素激动剂药物无交叉反应。4.添加回收实验。将建立的检测CL的ELISA方法应用于猪肝脏组织的添加回收实验,样品经前处理后用于测定。当样品处理液作4倍以上稀释时,样品基质干扰基本消失。在0～50ng/mL范围内,曲线标准方程：y=-0.4114x+0.7063,R2=0.9886,IC50为4.39ng/mL,LOD低于0.5ng/mL.用5.10.50ng/mL的盐酸克伦特罗标准液做添加回收实验,经检测肝脏药物回收率在85%～100%之间,批内差异在4.12%～6.71%之间,批间差异在5.08%～7.13%之间。