背景：神经病理性疼痛最新定义是指躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛而激发或引起的慢性疼痛疾病,在临床治疗过程是一个非常艰难的问题,对人们的生活问题有很大的影响。它是一种以异常痛敏、自发痛、痛觉过敏相关症状的慢性疼痛。现阶段对其具体的发病情况是不了解的,这种疾病的发生时每年都在上涨,治疗非常的紧急但是对于目前治疗情况不是很好,在临床医学中的研究挑战性性是非常大的。大量实验证明在神经病理性疼痛的产生和维持时中枢敏化和外周中发挥了很重要的作用。一氧化氮(NO)是神经元细胞内一种新型的神经递质,它由一氧化氮合酶(NOS)催化而成。在神经系统(nervous system)中的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)是NO合成的关键酶。大量研究表明,nNOS调节就像神经病理性疼痛和炎性痛这类的多种生理和病理过程,nNOS发挥了重要作用在中枢神经系统和外周中的神经病理性疼痛里。脊髓背角神经元中的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的过度表达可由外周神经(peripheral nervous)损伤所致,在除此之外还会有痛觉失常和痛觉过敏等症状[4]。要减轻坐骨神经慢性压迫(chronic constriction injury, CCI)或脊神经结(?)L(spinal nerve ligation, SNL)模型中的神经病理性相关的疼痛反应,可以在鞘内或全身注射选择性nNOS抑制剂或非特异性nNOS抑制剂；但是机械痛敏通过神经损伤所诱导的是不能通过nNOS敲除鼠显示出来的。这些实验数据都说明神经病理性疼痛都是有nNOS参与的。不同程度上nNOS的活性影响是可以通过对其不同位点进行磷酸化。要降低nNOS活性,就先对神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的Ser847位点进行磷酸化,而磷酸化钙调蛋白依赖激酶II (CaMKII)可以对其磷酸化,去制止与Ca2+-CaM的结合。nNOS活性是可以通过在Ser847位点磷酸化增加,通过降低去磷酸化。有大量实验数据表明,nNOS磷酸化是在激酶和磷酸酯酶像钙调蛋白、蛋白激酶A(PKA)、和蛋白激酶C(PKC)依赖激酶不同胞内外信号调节下的。有研究表明,nNOS在体内通过与其接头蛋白CAPON相互作用,从而发挥调控作用。但nNOS其接头蛋白CAPON相互作用强度降低,不知是否是由于nNOS被CaMKII磷酸导致的,从而导致疼痛阈值增加也尚不得而知。目的：通过建立SNL神经病理性疼痛模型,采用行为学,免疫蛋白印迹方法,免疫共沉淀与激光共聚焦实验,观察SNL术后脊髓组织中CaMKII磷酸化水平(活性)的变化,并鞘内注射pCaMKII特异性抑制剂KN93,观察其镇痛疗效和对脊髓背角和DGR中nNOS的表达量的影响,试图阐明是否是CaMKII通过磷酸化nNOS,降低nNOS与其接头蛋白CAPON在体内的相互作用,从而提高nNOS磷酸化在神经病理性疼痛中的镇痛作用。第一节神经病理性疼痛大鼠模型的建立与疼痛阈值的测定及pCaMKII与nNOS表达水平检测材料与方法：实验的对象是质量150～200g雄性SD大鼠。大鼠分笼饲养,大鼠饮食需要自由,间隔一天日以后换掉旧垫料。大鼠饲养的室内温度要一直在20～25℃,湿度50%～80%,循环在12～12h白天-黑夜进行照明。要使大鼠的痛苦尽量减轻在每一步实验时,使用原则操作必须按照有关实验动物所需要的进行。总共分组为2组是按照随机化原则所分,第1组模型组,选用大鼠15只,制作L5脊神经结扎(SNL)模型；第2组为假手术(Sham)组,选用大鼠15只,仅显露脊神经而不结扎。通过Von Frey filament测定大鼠神经结扎侧(左侧)后足缩足反射阈值(MWT)。结果：1、与假手术组相比SNL模型组大鼠术后3天、7天和14天痛阈值均明显降低(P<0.05),并且低于术前基础值(P<0.05)。2、术后3天、7天和14天,腰段脊髓组织中总CaMKII水平无明显变化,但是pCaMKII水平与假手术组相比则明显增加；腰段脊髓组织中总nNOS水平无明显变化,但是pnNOS水平与假手术组相比则明显降低。结论：1、SNL术后,明显降低(P<0.01)的是SNL模型组的热痛阈和机械痛阈较基础值及假手术组。2、外周神经损伤后,腰段脊髓组织中pCaMKII水平增加(P<0.05), pnNOS水平降低(P<0.05), pCaMKII与pnNOS可能参与神经病理性疼痛的形成。第二节pCaMKII特异性抑制剂KN93对脊髓背角和背根神经节nNOS磷酸化的影响及其对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用材料与方法：实验对象是体质量为150～200g的雄性SD大鼠。让这些自由饮食,要分笼饲养,每间隔一天要换掉旧的垫料。室内的温度要持续在20～25℃,保持的室内潮湿度要在50%～80%,12～12h白天-黑夜不间断的循环照明。做这些实验要按使用原则操作将实验所有步骤都尽量减轻大鼠的痛苦并按照有关实验动物的进行。按照随机化的原则分为4组,第1组模型组,选用大鼠15只,制作L5脊神经结扎(SNL)模型；第2组为阴性对照组,选用大鼠15只,制作SNL模型,术后1天,鞘内注射DMSO;第3组为实验组,选用大鼠15只,制作SNL模型,术后1天,鞘内注射KN93；第4组为假手术(Sham)组,选用大鼠15只,仅显露脊神经而不结扎。采用Westernblot方法测定腰段脊髓组织总pCaMKII, nNOS和pCaMKII、pnNOS水平。结果：1、与对照组和假手术组相比,SNL各组大鼠术后3天、7天和14天痛阈值均明显降低(P<0.05),并且低于术前基础值(P<0.05)。2、SNL术后3天、7天和14天,与假手术组比较,模型组和阴性对照组大鼠腰段脊髓组织pCaMKII表达增加(P<0.05),pnNOS的表达下降(P<0.05),在统计学上看实验组pCaMKII表达与假手术组差异是没有意义(P>0.05)。与模型组比较,实验组pCaMKII表达降低(P<0.05),pnNOS的表达增加(P<0.05),在统计学上看阴性对照组pCaMKII、pnNOS表达与模型组差异没有意义(P>0.05)。结论：1、大鼠的脊神经结扎(SNL)能明显降低机械痛阈和热痛阈；药物KN93提高大鼠机械痛阈和热痛阈。2、脊神经结扎(SNL)能促进大鼠腰部分的脊髓组织pCaMKII表达,降低pnNOS表达水平；pCaMKII特异性抑制剂KN93能逆转SNL诱导的慢性神经病理性疼痛。第三节nNOS与其接头蛋白CAPON的相互作用与大鼠疼痛阈值的关系材料与方法：第二节实验大鼠,在最后一次痛阈测定毕立即处死大鼠,迅速取出腰段脊髓冻存于-80℃备用。采用免疫共沉淀,检测nNOS与其接头蛋白CAPON的相互作用；采用免疫荧光技术,对大鼠腰段脊髓组织进行荧光双染,利用激光共聚焦显微镜对荧光双染结果进行拍照。结果：1、免疫共沉淀实验表明,nNOS与其接头蛋白CAPON的存在相互作用。2、免疫荧光实验后,采用激光共聚焦显微镜对荧光双染结果进行拍照发现,nNOS与其接头蛋白CAPON的存在相互作用；KN93能降低nNOS与其CAPON的相互作用强度。结论：1、nNOS与其接头蛋白CAPON的存在相互作用。。2、CaMKII对nNOS的磷酸化而导致nNOS与其接头蛋白CAPON相互作用强度降低,从而导致疼痛阈值增加。