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脂肪酶作为一种重要的工业用酶,在食品加工、精细化工、医药合成和生物能源等领域都有广泛的应用。多种微生物脂肪酶都已经被克隆和表达,常用的表达体系有大肠杆菌表达体系和毕赤酵母表达体系。前者是研究最为透彻的原核表达体系,后者是近年来发展最为成功的真核表达体系。脂肪酶规模化应用的前提是要获得高效表达的基因工程菌。因此,不同来源的脂肪酶基因采取了不同的构建和筛选基因工程菌的方法。对于BTLm脂肪酶,采用替换酵母偏爱密码子、体外合成等先进定向进化技术对脂肪酶基因进行改良研究,获得降解对硝基棕榈酸苯酯(p-Nitrophenyl palmitate,pNPP)能力和对碱性环境耐受性大幅提高的突变基因btlm,构建了高效表达的重组毕赤酵母基因工程菌。对于铜绿假单胞菌脂肪酶,构建了重组大肠杆菌基因工程菌。研究内容主要分为以下两大部分：1、将前期已成功构建的脂肪酶基因表达载体pPICZaA-btlm,酶切线性化后,通过电转化法整合到Pichia pastoris GS 115菌株细胞中；然后通过菌落PCR鉴定阳性重组子后,通过梯度浓度的zeocin平板筛选出高拷贝重组子；最后对高拷贝的重组阳性菌株12“进行诱导表达,并进行了表达条件优化,确定最佳培养条件；采用pNPP法检测脂肪酶活力,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白是否表达,并分析了其降解pNPP的特性。2、从铜绿假单胞菌(HS-D38)中克隆到1个脂肪酶基因lipAB,序列分析表明该基因编码区全长2007bp,编码1段由312个氨基酸残基组成的脂肪酶(LipA)和1段由283个氨基酸残基组成的伴侣蛋白(LipB),与已报道的铜绿假单胞菌脂肪酶基因(AB008452)同源性为99.4%。构建并筛选了脂肪酶基因lipAB的E. coli重组表达菌株,LipA和LipB分别实现了表达,且LipA在LipB的协助下具有活性。本研究解决了脂肪酶的转酯能力和高效表达等关键技术问题,利用P.pastoris真核表达系统成功实现了BTLm脂肪酶的高效表达,并利用E.coli原核表达系统实现了lipAB基因的活性表达。为后续分离纯化工作以及酶法生产生物柴油的研究奠定了良好基础。