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目的:顺铂耐药是目前治疗肺癌过程中要面临的主要难关。耐药肿瘤的基本特征之一就是代谢异常,特别是糖酵解异常,但其作用机制尚未被完全阐明。N6-甲基腺苷(m6A)mRNA修饰在调节肿瘤细胞的多种生物学功能有着关键作用,影响癌症的发生发展。但是它的功能,特别是关于癌症代谢重编程的研究在很大程度上仍然是未知的。我们发现,在肺癌细胞耐顺铂过程中存在mRNAs的m6A修饰,甲基转移酶3(Methyltransferase like3,Mettl3)的缺失使得m6A甲基化水平下调,并抑制耐顺铂肺癌细胞的代谢能力,特别是糖酵解能力。丙酮酸脱氢酶激酶4(Pyruvate Dehydrogenase Kinase 4,PDK4)是癌细胞进行有氧糖酵解关键的上游调节基因,同时也被认为是关键的耐药基因,在耐药肿瘤的发生发展中起着关键作用。本文通过探讨m6A调控耐顺铂肺癌细胞的糖酵解过程及PDK4翻译的作用机制,为有效克服肿瘤耐药提供一种新的思路及方向。方法:1.常规体外培养人肺腺癌细胞株A549以及耐顺铂细胞A549/CDDP,分别检测细胞的ATP含量、葡萄糖摄取能力及产乳酸能力,比较癌细胞及耐药细胞之间的代谢差异。采用Seahorse细胞能量代谢实时测定仪检测细胞的线粒体呼吸能力及糖酵解活性,进一步确定耐药细胞的主要产能方式。2.LC-MS/MS检测肺癌细胞A549在耐药过程中mRNA m6A水平表达。Western blot检测肺癌细胞A549及A549/CDDP中Mettl3、ALKBH5的表达,进一步证明在细胞耐药过程存在m6A修饰。3.分别运用RNA干扰沉默Mettl3的表达或质粒转染过表达ALKBH5,检测相应细胞的葡萄糖摄取能力、产乳酸能力、ATP能力以及糖酵解能力。证明m6A影响耐顺铂肺癌细胞的代谢过程并调节其糖酵解能力。4.Western blot检测肺癌细胞A549及A549/CDDP在过表达Mettl3或沉默Mettl3的条件下检测PDK4表达,并分别检测相应细胞的葡萄糖摄取能力、产乳酸能力、ATP能力及细胞增长率。证明PDK4参与耐顺铂肺癌代谢过程5.m6A-RT-PCR、细胞核质分离、核糖体图谱展示技术等方法探讨m6A对PDK4转录、剪切、翻译、胞内分布及降解过程的影响。6.双荧光素酶报告基因、免疫共沉淀等方法探讨m6A影响PDK4具体作用机制。7.公共数据库筛选肺癌基因表达谱,对Mettl3、YTHDF1以及PDK4进行差异表达分析,明确Mettl3、YTHDF1和PDK4在肺癌中的差异表达。结果:1.耐顺铂肺癌细胞A549/CDDP的代谢能力更强:ATP含量、葡萄糖摄取和产乳酸能力均比A549细胞强,同时,A549/CDDP主要依靠糖酵解方式产能。2.肺癌A549细胞耐顺铂过程存在m6A修饰。LC-MS/MS检测到肺癌耐药A549/CDDP细胞mRNA m6A水平显著提高,Western blot结果显示甲基转移酶Mettl3在A549/CDDP中表达升高,而去甲基化转移酶ALKBH5表达没有变化。3.甲基转移酶Mettl3促进耐顺铂肺癌A549/CDDP的耐药性及糖酵解。细胞在敲掉Mettl3或过表达ALKBH5后均可使A549/CDDP细胞代谢能力降低:葡萄糖摄取、产乳酸能力和产ATP能力均比A549细胞弱。同时,敲掉Mettl3后A549/CDDP的糖酵解能力降低,对顺铂的敏感性增强。4.PDK4参与Mettl3促进耐顺铂肺癌A549/CDDP细胞的糖酵解过程。Western blot结果显示PDK4在耐药细胞A549/CDDP中表达升高,而在细胞敲除Mettl3后,PDK4表达明显下调。细胞敲除PDK4可引起耐药细胞的代谢能力及增殖能力变弱,同时,敲除Mettl3的细胞代谢能力下降及增殖能力变弱,在过表达PDK4后抑制程度得到逆转。这些结果表明PDK4参与Mettl3促进耐顺铂肺癌细胞的糖酵解过程。5.m6A促进PDK4在耐顺铂肺癌细胞A549/CDDP的蛋白稳定性及翻译。A549/CDDP shM3细胞相较于对照细胞A549/CDDP,PDK4成熟体mRNA和前体mRNA(pre-PDK4)表达量无明显变化,启动子活性实验、核质分离实验结果表明PDK4 mRNA的亚细胞定位无变化。采用Act-D检测细胞RNA半衰期,发现pre-PDK4和PDK4在对照细胞和A549/CDDP shM3中的半衰期无明显变化,说明pre-PDK4的剪切和成熟体PDK4的降解没有受到m6A影响。采用CHX以检测细胞蛋白的稳定性,结果显示在A549/CDDP shM3细胞中PDK4蛋白的半衰期明显短于对照细胞,表明m6A影响PDK4的蛋白稳定性。同时,用MG-132抑制蛋白酶体活性检测两组细胞中PDK4蛋白降解程度,结果发现两种细胞中PDK4蛋白降解没有受到m6A的影响。通过核糖体图谱展示技术分离RNA组份结果显示,A549/CDDP shM3细胞中单核糖体组装及多核糖体的形成少于对照组,并且,RT-PCR结果表明A549/CDDP shM3细胞中多核糖体组份中的PDK4 mRNA明显少于对照细胞。这些结果提示m6A修饰PDK4促进其蛋白翻译。6.3’UTR区是m6A修饰促进PDK4翻译的具体位点。通过m6A修饰位点预测网站(http://www.cuilab.cn/sramp),我们发现PDK4 mRNA上存在4个潜在的m6A基序,其中1个位于5’UTR,3个位于3’UTR区。构建PGL3-PDK4-5’UTR,将质粒分别转入A549/CDDP shNC及A549/CDDP shM3细胞中发现翻译效率并无变化。同时,我们构建pmirGLO-PDK4-3’UTR,并分别突变潜在的3个m6A位点(“GGAC”to“GGCC”),将这4个质粒分别转入细胞中,发现突变3’UTR区潜在的第1个m6A位点后A549/CDDP shM3细胞中PDK4表达的下调得到逆转。这些数据表明PDK4 3’UTR区的m6A修饰影响PDK4的翻译。同时,RIP-PCR检测的结果发现YTHDF1在A549/CDDP shM3细胞中富集的PDK4 mRNA少于对照组中细胞富集的量。在耐药细胞A549/CDDP中转染si-YTHDF1后,发现PDK4的蛋白表达降低。真核生物延长因子eEF-1在A549/CDDP shM3细胞中富集PDK4的量低于在对照细胞中富集的量。Co-IP结果进一步发现YTHDF1与eEF-1的结合在A549/CDDP shM3细胞中减少。这些数据表明YTHDF1与eEF-1介导了m6A修饰促进PDK4的翻译过程。7.m6A在肺癌临床发展的作用。通过分析公共数据库人类肺癌表达谱(GSE40791)共194例临床病例,结果表明Mettl3和YTHDF1 mRNA水平在肺癌中高于癌旁组织,并且肺癌T1期发展到T4期过程中,PDK4的表达水平逐渐升高,说明肺癌恶性转化过程中PDK4的表达呈上升趋势。结论:肺癌A549细胞耐药过程中m6A水平显著升高,敲除Mettl3的表达后PDK4的表达明显受到抑制,肺癌耐顺铂细胞A549/CDDP的糖酵解能力也显著降低。此外,我们的结果进一步证实m6A通过修饰PDK4 3’UTR促进PDK4 mRNA的翻译,而YTHDF1、eEF-1通过与PDK4 3’UTR的m6A位点相互作用从而促进其翻译延伸。