论文部分内容阅读
研究背景随着电力工业发展和家用电器日益普及,环境极低频电磁场(Extremely Low Frequency Electromagnetic Fields,ELF-EMF)(0-300 Hz)暴露的健康效应备受公众关注。基于有限的流行病学研究证据,国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)于2002年将环境极低频磁场归类为人类可疑致癌原(2B)。然而,这一结论缺乏极低频磁场暴露致癌(促癌)作用的实验室研究证据支持。为此,开展系统性实验室研究,明确极低频磁场的生物学效应并探索阐明其作用机制是当前最为迫切的任务。另一方面,公众往往同时暴露于环境多种化学污染物和电磁场等物理因素。已有流行病学研究结果显示,电磁场相关职业工种(并非电磁场暴露水平)与特定疾病发生风险增加相关,提示电磁场可能复合其他职业环境因素暴露产生健康危害。因此,研究极低频磁场和化学物复合暴露的生物学效应及作用机制,有助于阐释真实电磁环境及复合暴露健康危害的机理。研究思路我们实验室前期以来源不同系统(或组织)的代表性细胞、来源同一系统的不同类型细胞、不同遗传背景(如基因敲除)同类型细胞等为候选细胞,系统筛选电磁场敏感细胞,并确定人绒毛膜癌细胞JAR和JEG-3为电磁场敏感细胞。有意思的是,JAR和JEG-3两种细胞响应电磁场存在明显的差异性。因此,本学位论文首先以人绒毛膜癌细胞JAR为模型,将细胞单独暴露于50 Hz磁场,以CCK-8试验方法分析50 Hz磁场对细胞活力的影响,并比较分析JAR和JEG-3细胞响应50 Hz磁场的异同。同时,我们利用CCK-8试验方法分析低剂量镉或铬单独暴露及镉和铬复合暴露对JAR和JEG-3细胞活力的影响,确定低剂量镉和铬作用于细胞的损伤阈值,建立复合暴露细胞模型。然后,将JAR和JEG-3细胞复合暴露于50 Hz磁场和低剂量镉,确定复合暴露条件下,50 Hz磁场对细胞活力的影响。为了进一步探索50 Hz磁场与低剂量化学毒物复合暴露影响细胞活力的机制,我们以JAR细胞为模型,利用液相色谱-质谱联用技术分析50 Hz磁场暴露及其与镉复合暴露对细胞蛋白质表达谱的影响,筛选差异表达蛋白质。研究结果一、50 Hz磁场暴露对JAR细胞活力的影响JAR细胞经3.0 mT的50 Hz磁场单独暴露1、6、24、36和48小时后,采用CCK-8分析细胞活力。结果显示,与假暴露组相比,3.0 mT的50 Hz磁场暴露6小时(p<0.05)、24小时(p<0.01)48小时(p<0.01)组JAR细胞的细胞活力显著增加,而暴露1小时组细胞活力没有显著变化。同时,我们分析了 3.0 mT的50 Hz磁场单独暴露对JEG-3细胞活力的影响,结果显示,与假暴露组相比,3.0 mT的50Hz磁场暴露1小时组细胞活力没有显著变化,6小时(p<0.05)和24小时(p<0.01)组细胞活力显著增加,但暴露48小时(p<0.05)组细胞活力显著降低。二、50 Hz磁场和低剂量镉复合暴露对JAR细胞活力的影响为建立复合暴露模型,我们首先分析了镉和铬复合暴露对JAR细胞活力的影响,结果显示,与对照组相比,0.25 μM镉和0.50 μM铬复合暴露6小时、24小时或48小时组JAR细胞活力显著降低(p<0.01),提示成功建立化学物复合暴露细胞模型。在此基础上,我们分析了 3.0 mT的50 Hz磁场与2.5 μ镉复合暴露对JAR细胞活力的影响,结果显示,与2.5μM镉单独暴露组相比,3.0 mT的50 Hz磁场和2.5 μM镉复合暴露1小时细胞活力增加,但无显著性差异(p=0.079);6小时和24小时组JAR细胞活力显著增加(p<0.01),但48小时组JAR细胞活力无显著变化。同时,我们分析了 3.0 mT的50 Hz磁场与镉复合暴露对JEG-3细胞活力的影响,结果显示,与2.5μ 镉单独暴露组相比,3.0 mT的50 Hz磁场和2.5 μM镉复合暴露1小时、6小时或24小时组JEG-3细胞活力显著增加(p<0.01),但48小时组JEG-3细胞活力无显著变化。以上研究结果提示,3.0 mT的50 Hz磁场复合2.5 μM镉暴露能暂时性减弱2.5 μ镉暴露导致的JAR和JEG-3细胞活力抑制。三、50 Hz磁场和低剂量镉复合暴露影响JAR细胞活力的作用机制探索我们首先以细胞响应外界环境刺激蛋白——p53为研究对象,发现3.0 mT的50 Hz磁场单独暴露未能引起p53表达水平变化,2.5 μM镉暴露引起p53表达水平上升,而3.0 mT的50 Hz磁场和2.5 μM镉复合暴露抑制低剂量镉暴露诱导的p53表达水平上升,提示从关键响应蛋白角度分析复合暴露影响细胞活力的作用机制具有可行性。为进一步探索50 Hz磁场与低剂量化学毒物复合暴露影响JAR细胞活力的机制,我们采用液相色谱-质谱联用蛋白质组学研究技术分析50 Hz磁场复合低剂量镉暴露6小时对JAR细胞蛋白质表达图谱的影响。结果显示:1)与假暴露组相比,50 Hz磁场暴露组共引起16个蛋白表达水平发生变化,13个和3个蛋白表达水平分别上调和下调,以信号转导与蛋白质翻译及翻译后修饰等相关蛋白上调为主。2)与假暴露组相比,镉暴露组共引起111个蛋白表达水平发生变化,60个和51个蛋白表达水平分别上调和下调,除已报道响应镉暴露的金属硫蛋白外,以细胞骨架调节、信号转导与应激相关蛋白上调为主。3)与假暴露组相比,50Hz磁场与镉复合暴露组共引起162个蛋白表达水平发生变化,78个和84个蛋白表达水平分别上调和下调,主要以信号转导与蛋白质翻译及翻译后修饰相关蛋白下调、应激相关蛋白上调为主。4)与镉暴露组相比,50 Hz磁场与镉复合暴露组共引起163个蛋白表达水平发生变化,72个和91个蛋白表达水平分别上调和下调,主要以信号转导与蛋白质翻译及翻译后修饰相关蛋白下调、细胞骨架调节与代谢相关蛋白上调为主。以上研究结果提示,50 Hz磁场、镉单独暴露和复合暴露均不同程度引起蛋白表达变化;50 Hz磁场影响镉暴露引起的蛋白表达变化。结论根据以上研究结果,我们认为在本实验条件下,1)3.0mT的50Hz磁场能够促进JAR细胞活力,且存在暴露时间-效应关系;2)3.0 mT的50 Hz磁场能够显著减弱镉暴露对JAR细胞活力的抑制作用;3)50 Hz磁场暴露、镉暴露及50 Hz磁场复合镉暴露能引起信号转导、应激相关蛋白表达变化,复合暴露与镉暴露引起蛋白表达谱的变化不同,然而,50 Hz磁场影响这些蛋白表达变化进而影响细胞活力的真正机制还有待进一步研究。