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各种非生物胁迫,如极端温度、高盐和干旱等,严重影响农作物的生长和产量。小麦是世界重要的粮食作物之一,小麦逆境胁响应相关基因的鉴定与功能分析,对揭示植物抗逆性的分子机制以及小麦的抗逆育种具有重要的理论与实际意义。Ca2+作为第二信使,在植物逆境胁迫响应信号传导中具有重要作用。钙调磷酸酶-B类似蛋白(CalcineurinB-likeprotein,CBL),作为植物特有的Ca2+信号感受器之一,与Ca2+结合后可激活与其相互作用的蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase,CIPK),进而通过磷酸化修饰下游靶分子,启动一系列抗逆响应。本实验室前期对小麦(Triticum aestivum)CBL和CIPK基因家族开展了系统的鉴定、分析工作,发现小麦基因组中至少存在79个CIPKs基因,但其中大多数成员的生物学功能仍不十分清楚。本研究在小麦TaCIPK25基因表达模式分析的基础上,通过基因过表达技术,分析了 TaCIPK25转基因拟南芥和小麦对盐胁迫的响应,并对TaCIPK25参与的对盐胁迫响应的分子机制进行了探讨。本研究的主要内容和结果如下:1)TaCIPK25基因表达谱分析利用实时荧光定量RT-PCR技术,首先分析了TaCIPK25在小麦不同发育时期各器官中的表达模式。结果显示,TaCIPK25在小麦的根、茎、叶、胚芽鞘、雌蕊、雄蕊中都有表达,其中在胚芽鞘中表达量最高,茎中表达量次之,雄蕊中表达量最低;小麦幼苗经ABA和NaCl处理后,TaCIPK25在叶片和根中的表达均受到影响,且表现出相似的变化趋势,在叶中TaCIPK25的表达均表现出先下调后上调的趋势,而在根中均表现出下调的趋势,表明TaCIPK25可能参与了 ABA和NaCl盐胁迫信号通路。2)TaCIPK25和TaCBL1蛋白的亚细胞定位与共定位分析在前期的研究中,利用酵母双杂交实验分析了 TaCIPK25和8个TaCBLs的相互作用,发现TaCIPK25可以和TaCBL1相互作用。为了进一步研究它们的相互作用关系,构建了亚细胞定位的质粒pBI121-TaCIPK25-GFP、pBI121-TaCBL1-GFP和双分子荧光互补的质粒YCE-TaCIPK25和YNE-TaCBL1。利用基因枪轰击的方法,将上述质粒在洋葱表皮细胞中瞬时表达情况进行分析,实验结果显示:TaCIPK25-GFP在整个细胞中都有分布,而TaCBL1-GFP特异性地定位在细胞膜上;双分子荧光互补实验结果显示:TaCBL1与TaCIPK25共定位在细胞膜上,说明TaCBL1与TaCIPK25可以在植物细胞内互作,并且TaCBL1可以将TaCIPK25招募至细胞膜。3)TaCIPK25基因在转基因拟南芥中的功能分析为了分析TaCIPK25基因在逆境胁迫下的功能,首先利用农杆菌介导的花序浸染法,将TaCIPK25转化拟南芥,获到阳性转化株系,并对T3代转基因拟南芥和对照组(野生型拟南芥)进行盐胁迫下的表型分析。结果表明,在拟南芥中过表达TaCIPK25增加了转基因拟南芥植株对盐胁迫的敏感性,发现转基因植株中的Na+含量明显高于野生型。推测TaCIPK25的过表达增加拟南芥对盐胁迫的敏感性原因之一是通过Na+在细胞中的过量积累所导致的。4)TaCK25在转基因小麦中的功能分析为了深入研究TaCIPK25在盐胁迫下的功能,利用基因枪轰击小麦幼胚的方法,得到了TaCIPK25过表达转基因小麦,并分析了转基因和野生型小麦在盐胁迫下的表型。实验结果显示,在小麦中过表达TaCIPK25同样增加了转基因小麦对盐胁迫的敏感性;转基因小麦中的Na+含量明显高于野生型植株。通过测定小麦根部细胞的Na+/H+流动发现,转基因株系中的Na+外流明显降低,推测TaCIPK25可能减弱了细胞质膜上的Na+/H+反向转运蛋白的活性,导致Na+外排受阻。5)TaCIPK25基因启动子调控机制研究为了研究TaCIPK25基因表达调控机制,我们克隆了 TaCIPK25基因启动子,TaCIPK25基因启动子序列分析发现,其启动子含有5个WRKY转录因子结合位点W-box。为了研究WRKY转录因子对TaCIPK25表达的调控,我们选取了 3个具有代表性的 TaWRKYs(TaWRKY1、TaWRKY9 和 TaWRKY44),分别来自 TaWRKY 的三个亚家族。通过酵母单杂交、DPI-ELIESA实验、烟草中瞬时表达实验以及基因的表达分析发现,在盐胁迫条件下TaWRKY9蛋白可以结合TaCIPK25启动子上的W5-box,通过ABA依赖的途径负调控TaCIPK25基因的表达。