背景：　　 临床上，感染性疾病是导致患者死亡的最主要原因之一。大量数据表明：近年来，随着抗生素的滥用不仅加重了患者的负担，而且导致了越来越多的耐药菌株的产生，如VESA、MRSA，加大了疾病治疗难度，抗肿瘤药物、免疫抑制剂等药物的使用以及人群老龄化和免疫力低下人群的出现，使感染性疾病发病率呈逐年上升的趋势。创伤感染及其并发症已成为患者死亡与伤残的重要原因之一。而且全球日益恶化的自然环境和生态环境条件下所产生的新型疾病、愈演愈烈的人兽共患疾病等烈性传染病都使病原微生物的快速检验显得更加重要。因此，早期、准确对致病病原微生物进行诊断是确保提供有效治疗方案，提高患者预后，进一步降低其死亡率的最有效方法。快速检测技术及小巧便携式设备的研制将极大地丰富现有的检测手段，促进医学实验诊断水平的提高，赢得患者救治的时间，解决临床上急需解决的问题，从而最大限度地降低伤亡率，提高我国的医学实验诊断能力。这在当今全球大的自然灾害时有发生的情况以及新的公共卫生形势下尤其具有重要的意义。　　 传统的病原微生物的检测和鉴定主要是使用分离培养结合形态特性、生化鉴定、免疫分析的方法，存在操作复杂、特异性不强、所需时间长等缺点，且许多细菌培养要求高，生化特征、抗生素敏感型等表型特征不稳定，易受到基因调控、质粒获失及技术操作等方面的影响。后期发展起来的分子生物学技术由于其高效、快速的优势迅速在分子诊断领域得到了飞速发展，其中以PCR 技术为核心的核酸扩增方法使得微量靶分子的检测成为可能。但是如何确保PCR 产物的检测特异性和效率是一个极待解决的技术难题。电泳技术简便快捷，然而其分辨率有限，只能作为定性分析方法。　　 生物传感器是较新的一门学科，然而其一诞生则在实验室诊断领域获得了广泛应用。其检测原理是将生物信号转换为电信号，然后再转换为计算机可以识别的数字信号的过程。根据其转换方式的不同，可以将生物传感器分为电化学传感器、石英晶体微天平(QCM)、表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)等。其中SPR 生物传感器，集高效、灵敏、特异、结构小巧、经济实用等优点于一身，目前已成为生命科学领域的研究热点。它利用换能器，将待测的生物信号转换为电、声、光等可检测的物理信号，从而实现对样本中靶生物分子的检测。　　 本实验即是在前期研究平台基础上，将临床常见的四种感染致病菌：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭状芽孢杆菌为研究对象，充分利用细菌16S rDNA 序列的分子生物学特点，分别将生物素信号放大技术引入SPR 生物传感器，构建新型多通道SPR 技术监测系统，进而建立一种操作简单、灵敏度高、特异性强的微生物病原菌快速检测方法，为应用于野外、自然灾害等特殊领域提供坚实的实验基础。　　 方法：　　 1.在前期研究基础上，对SPR 生物传感器检测平台的硬件系统和软件系统进行改进，增加温控系统，加强电磁屏蔽，采用UMPHO-A450控制软件，对传感器检测系统的稳定性、重复性进行评价。对芯片自组装方法进行改进，采用SDS 再生液将亲和素修饰的寡核苷酸探针还原后再进行SPR 扫描，探讨探针固定影响因素，确定最适反应条件。　　 2.利用Vector NTi9.0软件套组对目标病原菌的16S rDNA 序列进行分析，确定16s rDNA 保守区域序列和可变区域序列；利用Primer Premier 5.0软件，针对16S rDNA保守区域序列，设计适用于目标病原菌的PCR 扩增通用引物；利用Array Designer 4.0软件设计针对各目标病原菌16S rDNA 可变区域序列的特异性寡核苷酸探针。探讨杂交反应的影响因素，优化反应体系，初步建立感染常见病原菌SPR 生物传感器检测方法。　　 3.以临床200例临床标本为检测对象，采用试剂盒法提取细菌基因组DNA，用于SPR 生物传感器检测；并以血培养鉴定法为参照方法，对建立的SPR 生物传感器微阵列检测方法进行方法学比较和评估，确定临床样本检测步骤。　　 结果：　　 1.成功构建适合野外环境下小型化SPR 生物传感器检测仪，检测仪规格为8通道串联检测池，进样台规格为4×4孔(1.5ml),4×8孔(0.5ml)，检测模式为平行检测，参考点：可根据需要设定1-3个参考点，进样流速范围为5-378μl/min,流速控制精度为±1μl/min，系统温度控制范围为15℃-50℃(室温25℃)，温控精度±0.5℃，样品回收方式为8通道可各自进行样品回收。检测系统稳定性良好，八通道间基本不存在干扰，达到了检测系统的要求。　　 2.利用设计的通用引物可以一次性完成所有靶细菌16S rDNA 序列的顺利扩增，电泳条带明亮清晰，具有较好的重复性。自行设计的探针特异性强、可靠性好，探针间Tm值相差仅为0.5℃，基本上具有相同的杂交条件，可用于传感器微阵列系统的检测。检测最适杂交温度为45℃，杂交检测时间为90min。　　 3.病原菌基因组DNA 试剂盒提取方法结果显示，该方法操作简便、污染机会少，而且效果好，能裂解所研究的所有菌种，PCR 产物电泳条带清晰明亮，无拖尾现象，可作为有效的样本前处理方法。检测的200例临床样本中，其中195例传感器检测结果，与临床检测结果相符合，灵敏度为97.3％，特异度为98％，可靠性为90％。　　 结论：　　 1.我们所构建的新型SPR 生物传感器微阵列，降低了温度和电磁效应对检测稳定性的影响，极大的减少了各检测通道之间的信号干扰，从而达到了传感器阵列化的要求，为DNA 检测提供了背景噪音低、性能稳定的微阵列检测平台。　　 2.自行设计的16S rDNA通用引物可以一次性对所有靶细菌16S rDNA 序列的顺利扩增；设计的寡核苷酸探针特异性好，具有相同的杂交条件，较大的增加了传感器微阵列的检测通量，简化了操作步骤。　　 3.构建的SPR 生物传感器检测系统，可以在4小时内同时检测四种临床感染常见病原菌，检测方法具有较高的灵敏度、特异性和准确性，技术稳定简单易于掌握，成本低廉。为临床病原菌的快速检测乃至其他基因检测提供一种新思路，有望克服临床常规检测方法存在的问题，满足临床快速诊断的迫切需求，具有广阔的应用前景。