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蛋白质的O-连接N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked N-Acetylglucosamine,O-GlcNAc)修饰是蛋白翻译后修饰的一种,在该修饰过程中单一的GlcNAc以β构型的方式连接于蛋白质的丝氨酸/苏氨酸的侧链羟基上。在真核细胞中,O-GlcNAc修饰过程是由O-GlcNAc转移酶(O-GlcNAc Transferase,OGT)和O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase,OGA)共同催化完成的动态修饰过程。O-GlcNAc修饰循环过程在绝大多数真核细胞中是保守的,酿酒酵母细胞中缺乏蛋白质O-GlcNAc修饰的酶。本论文在酿酒酵母细胞中表达OGT的不同亚型,构建了OGT各亚型独立的研究体系;此外,鉴定了表达sOGT的酿酒酵母中O-GlcNAc修饰的内源蛋白,并对新发现的O-GlcNAc修饰蛋白进行了验证。论文详细研究结果如下:(1)OGT三个蛋白亚型的主要差别是N端氨基酸序列的不同,我们的研究发现外源表达不同的OGT亚型对酿酒酵母生长抑制作用具有差异性,这些差异与OGT的N端氨基酸序列的不同组成密切相关;短OGT(short OGT,sOGT)对酿酒酵母的抑制作用依赖于其糖基转移酶的活性,而核质OGT(nuclear/cytoplasma OGT,ncOGT)和线粒体OGT(mitochondrial OGT,mOGT)的抑制作用不依赖于其催化活性;表达sOGT的酿酒酵母细胞可用于进行OGT的底物分析。(2)mOGT具有使其定位于线粒体内膜的N端基质导向序列(matrix targeting sequence,MTS)。在酿酒酵母中表达人源mOGT及其N端截短的突变体后,生长点板显示mOGT对酿酒酵母生长抑制作用依赖于其N端MTS序列;MTS序列的表达能引起酵母线粒体的融合,因此表达MTS序列的酿酒酵母有望成为哺乳动物细胞中mOGT过表达导致细胞凋亡的研究模型。(3)利用sWGA agarose对表达sOGT的酵母细胞中O-GlcNAc修饰的内源蛋白进行富集,并通过nanoLC-MS/MS鉴定到了468个O-GlcNAc修饰的酵母蛋白质,其中有13个被修饰的蛋白具有与其氨基酸序列一致性高于30%的人源蛋白,而且该人源蛋白的O-GlcNAc修饰状态在哺乳动物中尚未被报道。我们从中挑选了泛素结合酶2(ubiquitin-conjugating enzyme E2-16 kDa,Ubc5)、真核肽段释放因子的GTP结合亚基(eukaryotic peptide chain release factor of GTP-binding subunit,Sup35)、支链氨基酸转氨酶2(cytosolic branched-chain-amino-acid aminotransferase,Bat2)及组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,Esa1)等蛋白与sOGT在酿酒酵母中共表达,通过蛋白质的免疫沉淀及抗O-GlcNAc的蛋白印迹实验发现Ubc5、Sup35、Bat2及Esa1均被O-GlcNAc修饰,从而验证了我们的O-GlcNAc修饰蛋白的富集及质谱分析方法是可信的。(4)在表达sOGT的酿酒酵母中对Ubc5、Sup35、Bat2及Esa1同源的人源蛋白泛素结合酶2(ubiquitin-conjugating enzyme E2 D1,UBE2D1)、蛋白延伸因子1α样蛋白(elongation factor 1 alpha-like protein,HBS1L)、支链氨基酸转氨酶2(cytosolic branched-chain-amino-acid aminotransferase,BCAT2)及乙酰转移酶8(lysine acetyltransferase 8,KAT8)的O-GlcNAc修饰状态进行了研究,当UBE2D1、HBS1L或BCAT2与sOGT共表达时能检测到O-GlcNAc修饰信号。将酵母中检测到有O-GlcNAc糖基化修饰的人源蛋白在HEK293细胞中瞬时表达,同样通过免疫沉淀检测到UBE2D1、HBS1L、BCAT2在HEK293细胞中被O-GlcNAc修饰。综述以上研究结果,我们可以得出如下结论:通过在酿酒酵母及HEK293的双重验证实验发现,表达人源OGT的酿酒酵母细胞是良好的研究哺乳动物细胞蛋白质O-GlcNAc修饰的模式生物,而且为新的糖基化修饰底物的筛选开辟了一条新的途径。