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猪流感病毒是一种常见的猪呼吸道病毒,在猪中流行的流感病毒主要是H1和H3亚型。2009年爆发的甲型H1N1流感病毒在许多国家的猪体都大量分离到,如中国、美国、加拿大等。一些证据表明流感病毒能从猪传播到人,比如在猪场工作的工人的猪流感病毒H1N1和H1N2的抗体水平显著高于普通人。因此,急需研发出能快速、可靠、经济的检测猪流感病毒的试剂盒,为控制和净化猪流感病毒提供技术支持。流感病毒具有高度的变异性,即使是同一亚型内的病毒,其HA蛋白的变异也是很大的,很难筛选到同一株单抗能特异的识别同一亚类的所有毒株。因此,筛选通过联合互补作用能特异的识别同一亚型的大多数毒株的单抗,是制备高敏感性检测试剂盒的重要途径。本研究运用单克隆抗体技术,研制了两种猪流感病毒胶体金检测试剂盒,取得了如下成果。1.猪流感病毒H3亚型单克隆抗体的制备本研究通过对猪流感病毒H3亚型的HA蛋白序列进行进化分析,筛选出了两株遗传进化关系较远并且具有代表性的猪流感病毒H3亚型毒株GD3和HN3。对GD3和HN3毒株进行鸡胚接种增殖病毒,72h后收获尿囊液经灭活后,用蔗糖梯度离心,获得超离纯化病毒,分别免疫BALB/C小、鼠,取其脾细胞与SP2/0骨懿瘤细胞融合。用HI和ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,每株阳性杂交瘤细胞株经过3次克隆纯化后共筛选到15株抗猪流感病毒H3亚型的单克隆抗体。经试验测定,此15株单抗只与猪流感病毒H3亚型发生反应,而不与其他亚型的流感病毒发生反应,具有良好的特异性。2.猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒的研制及应用从15株抗猪流感病毒H3亚型的单抗中筛选出4株单抗,以1F6、3D1喷膜,2B8、4H9标金,制备出了能广泛识别猪流感病毒H3亚型的胶体金检测试剂盒。此试剂盒检测52份猪临床鼻拭纸及200份肺脏样品,分别检出了9份阳性鼻拭纸和7份阳性肺脏样品,对阳性样品进行病毒分离全为阳性,特异性为100%。用此试剂盒对其它亚型的流感病毒(H1、H5、H9、H10)进行检测,结果显示均为阴性；并且用此试剂盒对引起猪常见病毒病的病原(PRRSV、PRV、PCV2、CSFV)进行检测,结果显示均为阴性,具有很强的特异性。同时该方法操作简便、灵敏度高、稳定性好,为临床检测猪流感病毒H3亚型提供了新途径。3.猪流感病毒H3亚型和甲型H1N1二联胶体金检测试剂盒的研制以实验室制备并保存的抗甲型H1N1病毒的单抗2B3及本研究制备的抗猪流感病毒H3亚型的单抗为基础,建立了猪流感病毒H3亚型和甲型H1N1二联胶体金检测试剂盒。此试剂盒以1F6和3D1喷膜作为检测猪流感病毒H3亚型的检测线,以2B3喷膜作为检测甲型H1N1的检测线,以羊抗鼠的多抗喷膜作为质控线,把金标2B8、金标4H9及金标2B3涂布在结合垫上,制备了特异性好、灵敏度高、稳定性高的猪流感病毒H3亚型和甲型H1N1二联胶体金检测试剂盒。此试剂盒检测H3亚型病毒、甲型H1N1病毒呈阳性,检测经典H1N1猪流感病毒、H5亚型流感病毒、H9亚型流感病毒、H10亚型流感病毒、PRRSV、PRV、PCV2、CSFV均呈阴性。此二联胶体金检测试剂盒对猪流感病毒H3亚型及甲型H1N1的诊断、防控及监测具有重要的意义,也为多联胶体金检测试剂盒的研发打下了坚实的基础。