研究背景:血吸虫病是一种危害严重的人兽共患病。成熟虫卵是血吸虫病的主要致病因素和传播血吸虫病的唯一因子。因此血吸虫病疫苗的研究主要集中于抗雌虫生殖、抗卵胚发育方面。近十余年来,我们课题组的研究已经证明:未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)免疫可诱导产生抗虫卵胚胎发育和抗雌虫生殖产卵的效果,SIEA诱导产生的体液免疫应答,在抗血吸虫病保护性免疫中起重要作用。抗SIEA免疫血清不仅与虫卵内胚胎结合,抑制和干扰卵胚的发育过程;而且还与雌虫卵黄腺及紧邻卵黄腺的肠腔内膜组织结合,使雌虫的生殖产卵功能受到影响。进一步研究发现,SIEA26-28kDa抗原分子是诱导保护性体液免疫应答的主要效应成分之一;但是SIEA26-28kDa天然分子分离纯化与批量制备困难,一直是困扰天然分子疫苗应用的难题。因此,通过获得高度特异性SIEA26-28kDa抗体作为探针筛选、分析并鉴定天然分子候选疫苗SIEA26-28kDa相关的编码基因,或许是解决问题的途径之一。近几年来,噬菌体单链抗体技术的发展,为我们快速获得具有与完整抗体相同抗原结合功能的单链抗体(scFv)提供了方便。研究目的:本研究旨在获得与日本血吸虫天然分子候选疫苗SIEA26-28kDa特异性结合的单链抗体,借此特异性单链抗体为探针筛选日本血吸虫cDNA文库,以期获得天然分子候选疫苗相应的编码基因。研究方法:(1)应用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟卵单链抗体库,以SIEA免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏总RNA,以总RNA为模板,逆转录合成cDNA第一链。以小鼠免疫球蛋白H链和L链可变区简并引物,cDNA第一链为模板,分别扩增出H链和L链可变区基因。SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得SIEA噬菌体展示单链抗体库。测定单链抗体库的库容、重组率和多样性。(2)以分离纯化SIEA26-28kDa天然分子抗原为靶,对单链抗体库进行四轮富集,运用集落挖掘法或ELISA法筛选针对SIEA26-28kDa分子的阳性克隆。将阳性克隆感染大肠杆菌HB2151,使可溶性单链抗体表达。SDS-PAGE,Western blot分别鉴定单链抗体的表达水平、分子量以及与SIEA26-28kDa的结合活性和特异性。(3)为了提高SIEA26-28kDa单链抗体的可溶性表达量,将特异性SIEA26-28kDa scFv基因序列克隆至PET32a原核表达载体,构建PET32a/scFv原核表达质粒;另一方面,为获得EGFP标记的scFv,扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因,克隆至PET32a/scFv质粒,构建PET32a/EGFP-scFv质粒。然后将原核重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中,在大肠杆菌中诱导重组蛋白的表达,SDS-PAGE,Western blot分析确定单链抗体融合蛋白Trx-scFv和Trx-EGFP-scFv的表达水平、分子量以及与SIEA26-28kDa的结合活性和特异性。Trx-EGFP-scFv融合蛋白与日本血吸虫成虫和虫卵组织切片孵育,荧光显微镜观察GFP信号以评价特异性单链抗体的靶向性。(4)以高表达的特异性SIEA26-28kDa单链抗体为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,对获得的阳性克隆测序,通过NCBI的Blastn、Blastp程序进行核苷酸和蛋白质水平的同源性分析。(5)以日本血吸虫尾蚴cDNA文库作模板,扩增SIEA26-28kDa天然分子候选疫苗相关编码基因的全长编码区,构建pQE30原核重组表达质粒。将重组表达质粒导入大肠杆菌M15中,诱导重组蛋白的表达,SDS-PAGE,Western blot对融合蛋白表达水平,分子量及免疫反应性进行分析。(6)以日本血吸虫尾蚴cDNA文库作模板,扩增SIEA26-28kDa天然分子候选疫苗相关编码基因的全长编码区,构建pcDNA3真核重组表达质粒。将昆明小鼠分为生理盐水免疫组;pcDNA3空白质粒免疫组:pcDNA3/SjRPS4重组质粒免疫组;pcDNA3/SjRPL7重组质粒免疫组。分别用空白质粒、重组质粒、生理盐水免疫小鼠,免疫完毕,日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠,用减虫率,每克肝、肠减卵率及每雌子宫内减卵率,对目的基因动物免疫保护性效果进行评价。研究结果:(1)构建了日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原单链抗体库,库容为2.27×10~7,从随机挑选的克隆中均能扩增出大小约780bp的单链抗体片段;而且BstNI酶切图谱呈多样性。(2)通过集落挖掘法筛选SIEA单链抗体库,获得了针对SIEA26-28kDa的特异性单链抗体,该特异性单链抗体分子量约为32kDa,但可溶性表达量较低。识别SIEA于26-28kDa的位置,条带单一且明显。(3)通过双酶切、PCR和测序鉴定,证实原核重组表达质粒PET32a/scFv和PET32a/EGFP-scFv构建成功。可溶性Trx-scFv和Trx-EGFP-scFv融合蛋白在大肠杆菌中均获高效表达。而且融合蛋白分子量与理论预期值完全一致,同时还保存了与SIEA26-28kDa天然分子的结合活性及特异性。EGFP标记SIEA26-28kDa单链抗体免疫荧光定位结果显示:荧光主要集中于未成熟虫卵卵胚、雌虫生殖系统及与生殖系统邻近的肠腔组织,而在雄虫的肠壁仅见微弱荧光。(4)以SIEA26-28kDa单链抗体为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,获得两个编码SIEA26-28kDa疫苗候选分子的基因:日本血吸虫核糖体蛋白S4(SjRPS4)和日本血吸虫核糖体蛋白L7(SjRPL7)。(5)双酶切、PCR和测序鉴定表明重组质粒pQE30/SjRPS4,pQE30/SjRPL7构建成功。SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组融合蛋白分子量大小与预期完全一致,并且得到了高效表达,能被特异性SIEA26-28kDa单链抗体、日本血吸虫感染鼠血清识别。不能被正常鼠血清识别。(6)双酶切、PCR和测序鉴定表明重组质粒pcDNA3/SjRPS4,pcDNA3/SjRPL7构建成功。动物实验结果表明,与对照组比较,pcDNA3/SjRPS4,pcDNA3/SjRPL7真核重组质粒免疫组减虫率、减卵率均明显高于对照组,具统计学意义。结论:(1)高质量的SIEA单链抗体库得以成功构建,其库容量大、重组率高、多样性好,可实现对疫苗候选分子特异性单链抗体的高通量筛选。(2)应用集落挖掘法筛选SIEA单链抗体库,快速获得了针对SIEA26-28kDa天然分子候选疫苗的特异性单链抗体。(3)SIEA26-28kDa单链抗体具有与完整SIEA26-28kDa抗体相同的特异性、结合力及靶向性,且易于通过基因工程实现大批量生产,可完全代替完整的SIEA26-28kDa抗体,用于下一步研究。(4)特异性SIEA26-28kDa单链抗体作为探针,筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,获得了天然分子候选疫苗SIEA26-28kDa相应的两个编码基因SjRPS4和SjRPL7。(5)SjRPS4-6×His和SjRPL7-6×His原核重组表达蛋白具有很好的免疫反应性;pcDNA3/SjRPS4和pcDNA3/SjRPL7免疫小鼠,均获得明显抗血吸虫病免疫保护性效果;减卵率普遍高于减虫率,表明SjRPS4和SjRPL7两基因可能主要在抗血吸虫卵胚发育或抗雌虫生殖方面起重要作用。为日本血吸虫天然分子SIEA26-28kDa蛋白组分中有效的疫苗候选分子。