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目的:本研究拟采用丧失性功能实验探讨胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)和组蛋白去甲基化酶6A(KDM6A)在炎症微环境下对牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的影响及分子调控机制,为炎症微环境下牙周组织再生寻找治疗靶点。方法:1.PDLSCs的收集与分离培养,并通过流式细胞术检测其表面抗原标志物。2.分别建立IGFBP5稳定敲低的细胞系,KDM6A稳定敲低的细胞系,并进行成骨诱导分化。在成骨诱导条件培养下过通过CCK-8检测细胞增殖能力,Annexin V检测凋亡变化,碱性磷酸酶活性、碱性磷酸酶染色检测、茜素红染色检测TNF-α、IL-17对牙周膜干细胞分化及生物学特性的影响。3.通过Real-Time PCR检测IGFBP5丧失性功能实验中的PDLSCs在体外成骨诱导条件培养下,炎症因子对PDLSCs的成骨分化相关标志性基因及相关的组蛋白去甲基化酶表达的影响。检测KDM6A低表达后PDLSCs的成骨分化基因表达变化,并通过流式细胞仪微球捕获芯片技术分析其相关炎症因子的变化。4.通过Western-blot检测炎症因子作用下成骨诱导条件培养下KDM6A低表达的PDLSCs,细胞质内p-p65、β-catenin蛋白及细胞核内p-p65蛋白的表达变化。结果:1.通过成骨诱导分化培养基定向诱导IGFBP5低表达的PDLSCs,在炎症因子作用下,碱性磷酸酶染色检测显示蓝染程度减弱。碱性磷酸酶活性检测发现TNF-α、IL-17刺激后的IGFBP5低表达的PDLSCs碱性磷酸酶活性降低。实时定量Real-time RT-PCR结果显示成骨诱导分化组中,TNF-α、IL-17处理后成骨分化的相关基因OCN及BSP表达显著降低,组蛋白去甲基化酶KDM2A、KDM3B、KDM5B、JMJD6也有显著变化。(P<0.05,n=3)2.磷酸酶染色结果显示KDM6A低表达的PDLSCs在TNF-α、IL-17刺激后染色效果减弱;茜素红染色结果显示炎症因子刺激下KDM6A低表达后染色效果并无显著变化;通过细胞增殖检测结果可以确定KDM6A丧失性功能实验中的PDLSCs在成骨诱导分化过程中加入TNF-α、IL-17刺激后,与对照组相比并无明显差异。通过细胞凋亡检测结果可以确定KDM6A低表达后的PDLSCs,加入TNF-α、IL-17刺激后细胞凋亡略有增加。Real-Time PCR结果显示在TNF-α、IL-17刺激后,成骨分化重要标志基因RUNX2、BSP、OCN m RNA的表达显著下降。流式细胞仪微球捕获芯片技术检测结果显示KDM6A低表达后的PDLSCs,炎症因子IL-6的表达显著升高。(P<0.05,n=3)3.Western-blot检测结果显示,在KDM6A敲低的PDLSCs成骨诱导分化条件培养下,加入TNF-α、IL-17刺激后,细胞质中β-catenin蛋白水平显著降低。结论:1.IGFBP5可以促进炎症因子TNF-α、IL-17刺激下的PDLSCs成骨分化。2.KDM6A可以促进炎症因子TNF-α、IL-17刺激下的PDLSCs成骨分化。3.KDM6A对炎症因子TNF-α、IL-17刺激下PDLSCs成骨分化的促进作用,可能与其促进Wnt/β-catenin信号通路有关。