目的:类风湿关节炎（RA）是一种主要累及中小关节,以关节肿胀、疼痛为主要临床特点的自身免疫性炎症性疾病,至今病因不明。目前的研究表明,CD4+和CD8+T细胞促炎亚群及其分泌的促炎细胞因子可通过比例上调或功能增强引起和加剧体内免疫失衡,参与RA发生、进展的各个阶段。尽管近年来对RA发病机制中T细胞及其分化亚群的重要性已有深刻认识,但有关患者体内T细胞及其亚群的促炎功能发挥及转录调控因子调控仍不完全清楚。同时,以往研究报道更多地关注体外细胞因子的功能作用,而RA是一种体内免疫调控紊乱的复杂炎症性疾病,多种炎症细胞之间,及T淋巴细胞的各亚群之间,在功能上既可彼此促进又可互相拮抗,最终诱发和加剧RA免疫平衡调控的紊乱。因此,在RA疾病状态下,探索T细胞促炎亚群分化和促炎功能发挥的调控因子具有重大意义。分化抑制因子2（Id2）是一种核内转录调控蛋白分子,广泛表达于多种具有增殖能力的细胞类型,在T细胞等免疫细胞中表达上调,参与调控细胞发育、免疫活化、效应增殖、分化选择、凋亡等各个生理阶段。有文献报道,Id2参与调控胸腺内T细胞的成熟过程,能够影响发育成熟的初始T细胞的数目和比例。最近的研究表明,Id2可以阻断E蛋白结合Foxp3基因上游序列,抑制小鼠Treg的分化,转而向Th17样细胞转化。此外,在急性病毒感染状态下,Id2的正常表达具有维持小鼠Th1细胞及终末分化CD8+T细胞正常增殖和分化的重要功能。但由于小鼠与人类的免疫应答之间存在着诸多差异,以及受到RA疾病状态下的免疫平衡紊乱的影响,Id2差异表达对T细胞的亚群分化及促炎细胞因子表达的调控作用仍需进一步研究。因此,为研究Id2在T细胞中的表达情况及其可能在RA疾病发生、进展及治疗进程中的功能意义,本课题通过比较RA患者与健康对照,及RA患者在治疗前后体内Id2的表达水平差异,在RA复杂炎症条件下研究Id2分子可能对T细胞亚群分化及促炎功能表达的作用。方法:1收集健康对照与RA患者的外周血或滑液样本,记录RA患者的基本信息、临床检验指标和疾病活动度评价指标等。采用流式细胞术检测样本中CD4+T细胞、Th1细胞、Th17细胞及CD8+T细胞亚群比例及亚群中Id2的表达水平。观察比较不同来源样本及不同疾病活动度等分组中各细胞亚群比例及其Id2表达水平,并分析Id2表达水平与疾病活动度指标及CD4+T细胞、CD8+T细胞中IFN-γ或IL-17表达水平的相关性。2募集初治或既往3个月内未接受过抗风湿类药物治疗的RA患者,按照治疗方案将患者分为两组:T细胞激活抑制剂药物（CTLA4-Ig）和肿瘤坏死因子拮抗剂药物（TNFi）治疗组,随访观察至少12周。在治疗前及治疗后4周及12周进行外周血样本采集,并进行病情评估和相关实验室检验。3应用流式CBA技术,检测分析RA患者在治疗前后血浆相关细胞因子如IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α等的水平变化,并比较与CD4+T细胞及CD8+T细胞中Id2表达水平的相关性。4利用CD8+T细胞特异性Id2敲除小鼠构建胶原诱导关节炎（CIA）模型,观察Id2敲除对小鼠模型发病和细胞表型的影响。此外,应用CTLA4-Ig治疗CIA小鼠,利用流式细胞术检测,比较治疗组与对照组小鼠脾脏T细胞活化指标CD25、CD69以及增殖指标Ki-67的表达水平。5采用Graph Pad Prism 8.3软件进行统计作图,p＜0.05表示差异具有统计学意义。结果:1 RA患者关节滑液中Th1细胞亚群比例明显高于RA和健康对照外周血;同时RA患者外周血中Th1细胞与Th17细胞比例在高疾病活动度组中明显增加;此外,CD8+T细胞在RA外周血中比例明显低于HC及RA滑液,而各组间CD4+T细胞比例无显著差异;相关性比较发现Th1细胞比例与疾病活动评价指标CRP和DAS28评分均存在显著正相关。2 Id2在RA患者及健康对照体内CD4+T细胞、Th1细胞、Th17细胞及CD8+T细胞中高表达;RA患者关节滑液CD4+T细胞、Th1细胞、Th17细胞及CD8+T细胞中Id2表达水平较健康对照及RA外周血均明显增高。RA外周血中,CD4+IFN-γ+T细胞Id2表达水平明显高于CD4+IFN-γ-T细胞;CD4+IL-17+T细胞中Id2表达水平则明显高于CD4+IL-17-T细胞;同时,与CD8+IFN-γ-T细胞相比,CD8+IFN-γ+T细胞Id2表达水平显著增高。此外,相关性分析显示RA患者CD8+T细胞中Id2表达水平与DAS28评分显著正相关;CD4+T细胞中Id2与IFN-γ或IL-17之间,及CD8+T细胞中Id2与IFN-γ间均显著正相关。3对RA患者治疗前后的外周血样本进行比较发现,CTLA4-Ig治疗4周后,患者外周血CD4+T细胞、Th1细胞、Th17细胞及CD8+T细胞中Id2的表达水平均显著降低,Th1细胞及Th17细胞比例也出现降低。此外,CTLA4-Ig治疗4周后,患者血浆中细胞因子IL-6的水平显著降低,但并未发现与Id2表达水平间的相关性。同时,在不同治疗反应（治疗有应答、无应答）的患者群组间,CD4+T细胞、Th1细胞、Th17细胞及CD8+T细胞中Id2的表达水平均未发现显著差异。4 CD8+T细胞特异性Id2缺失导致小鼠CIA发病率降低、炎症评分下降,并显著抑制CD8+T炎性细胞因子IFN-γ的表达。此外,利用CIA小鼠模型观察CTLA4-Ig对T细胞激活及增殖的抑制作用,发现在CTLA4-Ig治疗后,小鼠脾脏T细胞的活化指标CD25和CD69表达率明显下降,增殖因子Ki-67的表达显著降低。结论:本研究进一步为T细胞特别是发挥促炎功能的自身反应性T细胞亚群在RA发生、进展及治疗过程中发挥重要作用提供了证据支持。首次观察到在RA体内CD4+T细胞、Th1细胞、Th17细胞及CD8+T细胞中Id2的普遍高表达,特别是在RA炎症病灶关节局部Id2表达水平的增高尤其显著;发现CD4+T细胞中IFN-γ、IL-17及CD8+T细胞中IFN-γ均与Id2表达水平显著正相关,提示在RA疾病进程中Id2可能促进了T细胞亚群部分炎性细胞因子的表达。T细胞激活抑制剂药物CTLA4-Ig治疗导致CD4+T细胞、Th1细胞、Th17细胞及CD8+T细胞中Id2水平出现显著下降,Th1细胞与Th17细胞的比例出现降低;而TNF-α治疗未观察到类似效果。此外,动物实验结果表明CD8+T细胞特异性Id2缺失可能通过下调其炎性细胞因子IFN-γ的表达,抑制CIA模型的发生和发展;同时CTLA4-Ig治疗可有效抑制CIA小鼠T细胞活化及增殖水平;这些结果提示Id2表达水平的改变能够调控T细胞促炎亚群比例及炎性细胞因子的表达,且Id2表达水平又与T细胞激活有关,最终影响小鼠模型疾病进程。综上所述,本课题系统观察并揭示了不同疾病状态及治疗过程中RA患者体内T细胞亚群中出现的Id2表达差异,进一步支持Id2通过调控T细胞亚群比例及炎性细胞因子的表达参与RA炎症的发生、发展。这为研究Id2在T细胞亚群分化选择及促炎细胞因子表达调控中的具体分子机制,以及进一步探索调节RA免疫平衡的潜在靶点提供了初步的理论基础。