第一部分孟德尔遗传易感分枝杆菌病筛查方法的优化目的:改进IL-12/IFN-g轴功能完整性检测试验和流式细胞术(FCM)检测IFN-gR1和IL-12Rb1蛋白表达的试验,提高其准确性、敏感性和稳定性,缩短试验时间。方法:1.取正常人全血分为4组:(1)无刺激组;(2)BCG单独刺激组;(3)BCG与IL-12p70联合刺激组;(4)BCG与IFN-g联合刺激组。分别培养不同时间(24h,36h,48h)后,Q-RT-PCR检测IFN-g和IL-12B的m RNA表达水平。不同来源的正常人全血标本重复3次,选取最适培养时间。2.提取正常人全血PBMC加入不同浓度的PHA(7.5mg/ml,10mg/ml),刺激培养不同时间(48h,72h,88h)后流式细胞术(FCM)检测IFN-gR1和IL-12Rb1的蛋白表达。不同来源的正常人全血标本重复3次,选取最适刺激浓度与培养时间。1.IL-12/IFN-g轴功能完整性试验的最佳刺激培养时间为36h。2.FCM检测IFN-gR1和IL-12Rb1蛋白表达的PHA刺激最佳浓度为10mg/ml,最佳刺激培养时间为72h。结果:结论:本研究在前期建立Q-RT-PCR检测IL-12/IFN-g轴功能完整性和FCM检测IFN-gR1及IL-12Rb1蛋白表达的试验基础上,进一步优化,选取最佳刺激条件和细胞培养时间,提高了试验的准确性,灵敏性和稳定性,缩短了为临床提供信息的时间。第二部分孟德尔遗传易感分枝杆菌病筛查方法的应用目的:对临床23例新诊断的孟德尔遗传易感分枝杆菌病(Mendelian susceptibility to mycobacterial disease,MSMD)疑似病例进行筛查试验;并随访筛查方法优化前结果异常的病例;对筛查试验结果异常患儿的相关基因进行测序分析。方法:1.Q-RT-PCR检测23例疑似MSMD患儿的IL-12/IFN-g轴的功能完整性,FCM检测IFN-gR1和IL-12Rb1蛋白的表达。2.对MSMD筛查方法优化前的试验结果异常但未确诊的患儿进行随访,取得家长同意后进行复查。3.收集整理筛查试验优化后试验结果异常的9例患儿,和优化前未确诊的高度疑似MSMD的1例患儿的临床资料,结合筛查试验结果,对相关基因进行测序分析。结果:1.对临床23例新诊断MSMD疑似患儿进行Q-RT-PCR检测IL-12/IFN-g轴功能完整性及FCM检测IFN-gR1和IL-12Rb1蛋白表达试验(筛查试验),结果异常的患儿有9例,5男4女,平均起病年龄5.41m,其中6例有BCG接种后不良反应,另外3例中1例未接种BCG,2例无BCG接种不良反应,此3例均是女孩,有反复发热或感染及外胚层发育不良表型。2.MSMD筛查方法优化前,筛查结果异常但未确诊的患儿有6例,其中1例死亡,1例失访,其余4例恢复较好,有1例前来复查,功能完整性检测和蛋白表达试验结果均正常。3.对新筛查的23例MSMD疑似病例中9例筛查试验结果异常的患儿,以及随访病例中死亡的1例患儿(高度怀疑MSMD)共10例进行测序分析,发现NEMO基因新型错义突变1例,CYBB基因、IL12RB1基因和IL12B基因的大片段缺失各1例。结论:MSMD筛查方法优化后,可更快速为临床疑似MSMD患儿提供诊断依据,试验结果更加稳定,准确。临床疑似MSMD的患儿,90%以BCG的感染为首发症状,约40%有IL-12/IFN-g轴的功能损伤,但其中仍有60%未找到致病基因,提示可能存在更多的致病基因未被发现。第三部分NEMO基因新突变致少汗型外胚层发育不良伴免疫缺陷病1例目的:探讨1例少汗型外胚层发育不良伴免疫缺陷(EDA-ID)患儿的临床特征、基因突变,提高临床医生对本病的早期认识。方法:1.收集整理患儿临床资料,根据其临床表现及家族史,常规免疫学筛查除外常见原发性免疫缺陷病(PID)。2.Q-RT-PCR在m RNA水平检测患儿与对照IL-12/IFN-γ通路的完整性,并对患儿及其家系的NEMO基因进行测序分析。结果:患儿男,1m9d,反复发热,皮肤苍白干燥,头发稀疏,前额轻微突出,无牙胚发育,有真菌和BCG感染。全血经BCG与IFN-γ联合刺激后,与单独的BCG刺激比较,患儿IL12B的m RNA表达水平降低(P(27)0.05),而健康对照组IL12B表达水平明显增加。基因测序分析发现患儿NEMO基因第10外显子一个半合错义突变c.1241T(29)A,p.V414D,其母亲与二姨为相同位点的杂合突变。结论:反复发热伴BCG感染的男性患儿合并皮肤苍白无汗,毛发稀疏,无牙等外胚层发育不良表型时,应考虑NEMO基因突变,母系家族色素失禁的病史有助于诊断,结合IL-12/IFN-γ轴的功能完整性检测和基因分析,可以早期诊断X连锁EDA-ID。