论文部分内容阅读
研究背景同种或异种间囊胚互补再造器官已在啮齿类和大型哺乳类动物体内得到验证,因此利用囊胚互补在适当的宿主体内再造人源化肾脏器官具有可行性。通过囊胚互补再造人源化肾脏,其必要前提是获得肾脏发育缺陷或缺失的动物模型。猪与人在解剖、代谢、生理学、器官大小、基因组和细胞周期特征等方面具有很高的相似性,所以猪成为异种再造人类肾脏的理想动物模型。肾脏发育是一个连续而又复杂的过程,需要多种基因的不断调控。哺乳动物Six基因家族由Six1-6六个基因组成,其中Six1,Six4基因主要表达在肾脏发生的间质区,对肾脏发育具有重要作用。在小鼠的研究中发现,Six1基因敲除小鼠肾脏表现出单侧肾脏发育缺失现象或双侧肾脏严重受损。而同时敲除Six1和Six4基因则会导致输尿管芽和后肾间质出现严重发育缺陷,肾脏发育完全缺失。由于小鼠与猪之间存在种属差异,Six4与Six1基因的在肾脏发育中的功能是否具有一致性不得而知,所以本研究主要探讨通过敲除Six1与Six4基因来获得肾脏发育缺陷或缺失的猪模型。研究目的通过 CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated system)基因编辑技术和体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)来获得iSix1单基因和Six1/Six4双基因敲除胚胎,并通过胚胎移植(Embryo transfer,ET)获得猪胎儿,进一步验证通过对Six1与Six4基因的敲除对猪肾脏发育的影响以及能否获得肾脏发育缺陷或缺失猪模型。研究方法选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为CRISPR/Cas9敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),分别构建Six1基因和Six4基因的Cas9/sgRNA敲除打靶载体。通过将打靶载体与含G418抗性的质粒(pCMV-tdTomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs),并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,并进行基因型鉴定。利用双等位基因敲除完全相同的单克隆细胞作为SCNT的供体细胞,通过SCNT构建出Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除囊胚,并通过ET获得基因敲除猪胎儿。通过对猪胎儿进行基因型鉴定,确定是否为敲除胎儿;利用Western Blot和免疫组化来进一步确定Six1和Six4蛋白在敲除胎儿体内是否有表达;通过解剖,HE染色,Western Blot和免疫组化等来鉴定肾脏表型。研究结果分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染打靶载体经药物筛选后鉴定,获得Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。经同样方法共获得44个Six1/Six4双基因敲除单克隆细胞系,其中Six1-/-/Six4-/-细胞系为13个。借助克隆技术,获得Six1单基因敲除克隆猪胎儿3头,Six1/Six4双基因敲除猪胎儿16头。基因型鉴定结果显示所获得的3头Six1单基因敲除猪胎儿均为Six1基因敲除,且与供体细胞对应。16头Six1/Six4双基因敲除猪胎儿也是Six1和Six4双基因同时敲除,且与供体细胞对应。利用Western Blot和免疫组化检测发现Six1和Six4基因被敲除,且二者蛋白也停止表达。进一步解剖和病理分析发现,Six1基因的敲除造成了猪肾脏发育缺陷,输尿管芽(Ureteric bud,UB)无法正常分支导致集合系统发育不完整,而Six1/Six4双基因敲除敲除胎儿肾脏尽管有后肾间质(Metanephric mesenchyme,MM)和输尿管芽的形成,但是肾脏发育完全停滞,导致了猪肾脏发育完全失败。同时,Six1/Six4双基因的敲除也会导致胎儿发育受阻,造成致死现象。研究结论本实验运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和SCNT技术成功获得了 Six1单基因敲除猪胎儿和Six1/Six4双基因敲除猪胎儿。所建立的肾脏发育缺陷和缺失猪模型为进一步研究肾脏缺失模型和囊胚互补再生人源化肾脏提供了一个较好的研究基础。