研究背景和目的：自身免疫性疾病(Autoimmune Diseases,AID)是泛指机体免疫效应细胞或免疫效应分子,针对自身组织或细胞出现异常免疫应答反应,导致组织损坏或功能障碍的疾病,是一类发病率高,可侵袭全身系统,严重危害人类健康的、致残率、致死率高的疾病。该类疾病特点为血液中存在自身抗体和(或)致敏的淋巴细胞；组织器官损伤和功能障碍范围取决于自身抗原分布；患者以女性较多见,发病率随年龄的增长而增高；多数原发病病因不清,常呈现遗传倾向性；病程慢性迁延和反复发作,甚至成为终身痼疾；免疫抑制药物治疗有一定疗效。近年来,随着人们对AID认识的提高,临床经验的积累和实验室诊断技术的进步,其发病率明显上升,其总体发病率占世界人口的3%-5%,中国的发病人数在3到4千万。由于AID疾病起病时临床症状不明显,许多患者在诊断后病情已发展至中重度,不能得到很好的控制,严重的影响患者的生活质量,甚至出现残废。例如50%的RA患者在诊断后两年内发展成为中度功能丧失,是造成我国人群丧失劳动力和致残的病因之一：系统性红斑狼疮患者有45%-85%存在肾损害的临床表现,是造成患者出现严重的临床症状及死亡的常见原因,早期发现、早期治疗,可明显缓解、控制病情发展。因此AID疾病的早期筛查、早期诊断、早期治疗和监测是控制病情发展、改善预后的重要手段。在AID疾病的各种检测项目中,由于抗核抗体(ANA)与AID密切相关,是自身免疫反应的重要靶位,因此抗核抗体检测在AID疾病中一直处于重要位置,是临床上一项极其重要的筛选试验。随着人们认识的不断加深,抗核抗体(Antinuclear antibody,ANA)的定义已由原来传统的针对细胞核扩展到现在的整个细胞,指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。目前已发现了具有不同临床意义的三十多种ANA,常见的如抗dsDNA抗体和抗Sm抗体是系统性红斑狼疮的标志性抗体,而抗SS-A(Ro)抗体和抗SS-B(La)抗体则多出现于干燥综合症患者等。由于ANA在AID疾病出现明显临床症状之前就可存在,且病情稳定后其滴度逐渐下降,因此ANA的检测对于AID疾病的早期筛查、诊断和鉴别诊断、疾病活动度的判断及治疗效果的观察和指导临床用药等方面具有重要的意义。目前常用的检测方法主要有间接免疫荧光法(IIF)、ELISA、化学发光分析法、免疫荧光分析法、胶体金免疫层析法等。IIF法一直是临床常规的筛选试验,尽管该方法检测灵敏度高,但是需要手工操作和荧光显微镜观察,影响因素较多,尤其是经验不丰富者容易判断错误,而且因为操作时间长,临床上常采用批量检测,因而也常出现一周或二周才出一次报告的情况,不利于疾病的及时诊断。EILSA法,因可进行半定量检测,临床经常根据其浓度的变化判定病人的好转与否,从而制定下一步的治疗方案,因此在临床也得到了广泛的使用。由于ELISA方法也是批量检测,因此也存在标本量少时不能极时出结果,手工操作影响因素较多,结果重复性较差的缺点。IIF法和EILSA法,均存在出报告时间长,导致病人等待结果时间长,耽误病人的即时就医,从而影响疾病诊治情况。其他检测方法虽然检测时间较短,但由于检测仪器设备、试剂价格等方面的限制,或者处于初步的摸索研究阶段,检测方法仍不成熟,影响检测及诊断性能的因素仍需进一步改进。针对上述临床存在之问题,本课题在当今检验医学发展提出的POCT(Point Of Care Testing),即即时检验新领域背景下,致力于开发一种新的检测试剂即荧光免疫层析快速检测试剂盒,使用小型荧光免疫分析仪进行检测,花费时间在15分钟左右,因此简单、便捷,标本即到即检,既能解决病人等待时间长之问题,又能解决临床医生执行自身免疫性疾病临床诊断的路径问题,可以在各级医院临床推广使用,以提高自身免疫疾病的诊治水平。荧光免疫层析检测法是一种将免疫侧向层析技术、链霉亲和素-生物素放大系统和荧光检测技术三者结合起来的一种检测技术,该技术首次将荧光蛋白作为其标记物并结合了链霉亲和素-生物素放大系统,不仅提高了快速检测的稳定性也提高了试剂检测的灵敏性。同时检测速度快,整个分析过程只需要十五分钟左右。这种技术是课题组的多项专利技术融合,将它用于抗核抗体的快速筛查检测试剂盒的研发,可以填补抗核抗体的快速筛查领域中的空白。综上所述,本课题拟采用荧光免疫层析法用荧光免疫分析仪来检测血清标本中ANA及dsDNA,开发快速检测试剂盒,可用于AID的早期筛查和病情监控。方法：1、抗原的制备、纯化、鉴定及固化1.1抗原制备、纯化、鉴定：根据自身免疫性抗原自身特点采取有效的方法(如基因工程合成、质粒提取DNA等)制备抗原,纯化后利用商品化的单克隆抗体检测试剂盒和确诊为相关自身免疫疾病且ANA或dsDNA阳性的血清进行验证,以验证制备的抗原是否合格,然后进一步纯化浓缩,保证靶抗原的丰度与纯度。最后鉴定经过纯化浓缩处理后的抗原是否符合进一步研究的要求。1.2抗原固化：以PBS缓冲液系统稀释提取抗原至合适浓度,固定于NC膜上；加入待测不同稀释度的阳性标本,根据荧光强度调整缓冲液成分。对固化过程中的环境条件,分别在湿度45%、50%、55%和60%进行,以划线粗细均匀,无明显扩散、无明显疏水斑为佳；在稳定性能上,分别保存1、3、5、7、10天,用阳性标本检测比较荧光强度。2、荧光蛋白与抗体的结合生物素标记鼠抗人IgG抗体：用PBS溶液将待标记抗体稀释至相应浓度,放入适当的离心管中；DMF将生物素溶解至相应浓度,加入待标记抗体中,充分反应后,根据反应体系大小,加入一定量的0.1M的NH4C1,终止标记。4℃透析除去多余的生物素和NH4C1,透析好的标记抗体放入-20℃长期保存,或4℃保存近期实验备用。链霉亲和素标记荧光蛋白：从GeneBank中调取链霉亲和素基因sa、藻蓝蛋白β亚基cpcB、裂合酶基因alr0617、藻红胆素合成酶基因ho1、pebA和pebB的序列,设计引物,以藻总DNA作为模板进行PCR扩增获取目的片段转入质粒,选择同时携带链霉亲和素与蓝藻蛋白cpcB的融合基因,以及Histag标签。通过培养含有质粒的大肠工程菌,进行融合蛋白的表达,鉴定及纯化,获取链霉亲和素标记荧光蛋白。荧光蛋白与抗体结合能力检测：将生物素标记鼠抗人IgG抗体包被在96孔板,加入一定浓度的链霉亲和素标记荧光蛋白,通过微孔板检测仪检测荧光强度检测链霉亲和素标记荧光蛋白与鼠抗人IgG抗体结合能力。3、测试卡的制备及组装(a)样品垫,以玻璃纤维膜为载体,经样品垫处理液浸泡处理,烘干；(b)荧光蛋白结合垫,以玻璃纤维膜为载体,经结合垫处理液浸泡处理,烘干,将荧光蛋白经缓冲液稀释后,均匀喷在纤维膜上,烘干；(c)生物素化鼠抗人IgG抗体结合垫,以玻璃纤维膜为载体,经结合垫处理液浸泡处理,烘干,将生物素化鼠抗人IgG抗体经缓冲液稀释后,均匀喷在纤维膜上,烘干；(d)NC膜,结合有检测用固相抗原(检测线T)和质控用IgG抗体(质控线C；本研究dsDNA系统用羊抗兔IgG、ANA系统用羊抗鼠IgG),分别将抗原和羊抗兔(鼠)IgG抗体经缓冲液稀释后,用划膜仪均匀划至NC膜上,烘干；(e)吸水垫(f)底板,PS底板,带有不干胶,作为各成分粘贴的载体；上述(a)-(e)组分按顺序和层叠次序粘贴于PS底板上,切为4mm宽条状,得到测试条；(g)卡壳：依据测试条的组分分布设计模具,塑料成型制成卡壳；将测试条装入其中,完成测试卡制备。4、试剂盒反应条件优化及性能评价通过优化筛选合适的抗原抗体,优化抗原抗体反应浓度、反应时间、缓冲液体系、加样体积等参数,提高试剂盒准确性、精密度、灵敏度、特异性和稳定性,并形成稳定的生产工艺。对试剂盒进行性能评价,主要指标为：线性范围、精密度、灵敏度、特异性和稳定性。通过现有检测方法和研制的快速筛查测试卡检测结果相比较,评价结果的一致性,评价抗核抗体快速筛查试剂盒的临床使用效果。结果：1抗ds-DNA抗体检测试剂盒研制开发1.1生物素标记dsDNA抗原(Biotin-dsDNA)的制备：选择pGEM-T载体,pb3433,用LB培养基培养18h集菌后用碱裂解法提取其质粒DNA。使用限制性核酸内切酶将dsDNA切成具有粘性末端(游离氨基-NH2)的线性dsDNA,按照5mg/mL生物素酰肼水溶液：5%戊二醛：dsDNA水溶液=5：6：10比例混合搅匀,通过化学交联剂把活化的BSA与具有游离氨基的线性dsDNA连接,形成dsDNA-BSA包被抗原。1.2荧光探针制备：选择Merck Millipore Corporation公司的荧光微球,完成鼠抗人IgG与荧光微球偶联优化,最终确定将活化好的荧光微球调节pH值到7.2-7.4,加入抗体：微球比例为1：6,30℃反应30min性能为最佳。1.3反应条件优化、性能评价及临床比对分析：确定样本稀释比例为1：49(稀释50倍)本底抗干扰能力及灵敏度阴阳性符合率最佳。其检测范围为5.0-600.0IU/mL。批内精密度为8.50%,批间精密度为8.58%,分析灵敏度(检测低限)为3.22IU/mL,测试条稳定性在2-8℃环境里可存放12个月。通过样本测试比对分析,与广州南杰生物技术有限公司抗双链DNA抗体定量检测试剂盒(ELISA方法)之间具有很好的一致性,符合率>95%,其可较好的满足临床使用的要求。2抗核抗体六联检测试剂盒研制开发2.1抗原制备：通过基因合成所需的蛋白类核抗原,并成功进行表达鉴定。在NCBI上查询临床常见的人自身抗原的碱基序列和氨基酸序列,运用软件预测抗原表位,选择抗原表位并对密码子进行偏嗜性改造,采用人工合成方法合成抗原表位序列并插入至原核表达载体pET30a中。将重组质粒导入大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,表达的重组蛋白用镍离子亲和层析柱纯化,用荧光免疫法测定重组蛋白活性。2.2抗原固定：对6种抗原52-kD Ro/SSA、rRNP.Jo-1、SmD1、Scl-70 SSB-La进行固定,6种抗原按1：1：1：1：1：1混合均匀,在50℃烘箱烘干6小时,固定效果最佳。2.3荧光探针制备：鼠抗人IgG生物素标记条件优化,确定生物素：标记抗体=0.25：1,30℃水浴30min,PH=7.2-7.4标记效果最稳定。对生物素标记抗体浓度及荧光蛋白浓度比例进行了调试,确定了最佳的配比浓度(生物素标记抗体浓度为0.4ug/mL:荧光蛋白浓度为0.6U/L)30℃反应30min性能为最佳。2.4反应条件优化、性能评价及临床比对分析：确定样本稀释比例为1：99(稀释100倍)本底抗干扰能力及灵敏度阴阳性符合率最佳。其检测范围为10.0-500.0ug/L。批内精密度为12.53%,批间精密度为12.83%,分析灵敏度(检测低限)为8.03ug/L,试纸条稳定性盒在2-8℃环境里可存放12个月。其基本满足临床使用的要求。结论：1、本课题分析基因组双链DNA由于分子量过大容易导致NC膜层析堵塞,样本无法层析；而进行酶切处理容易导致分子大小不均一,批间差异可控度低等情况,最后选取低分子量的质粒为标记对象,采取碱裂解法提取。其纯度高,分子大小均一,批间重复性可控性好。再经过纯化、鉴定及固化、荧光蛋白与抗体的结合、测试卡的制备及组装、试剂盒反应条件优化及性能评价四项研究后成功研制了抗双链DNA(ds-DNA)抗体检测试剂盒(荧光免疫层析法)。该方法可以在15分钟内完成检测。确定样本稀释比例为1：49(稀释50倍)本底抗干扰能力及灵敏度阴阳性符合率最佳。其检测范围为5.0-600.0IU/mL。批内精密度为8.50%,批间精密度为8.58%,分析灵敏度(检测低限)为3.22IU/ml,试纸条稳定性盒在2-8℃环境里可存放12个月。通过样本测试比对分析,与广州南杰生物技术有限公司抗双链DNA抗体定量检测试剂盒(ELISA方法)之间具有很好的一致性,符合率达到95%,其可较好的满足临床使用的要求。2、应用基因工程方法利用原核表达系统成功表达了人自身抗原52-kDRo/SSA,rRNP, Jo-1,SmD1,Sc1-70以及SSB-La等六种抗原。再经过纯化、鉴定及固化、荧光蛋白与抗体的结合、测试卡的制备及组装、试剂盒反应条件优化等初步研制了抗核抗体六联免疫层析检测方法。该方法可以在15分钟内完成检测。确定样本稀释比例为1：99(稀释100倍)本底抗干扰能力及灵敏度阴阳性符合率最佳。其检测范围为10.0-500.Oug/L。批内精密度为12.53%,批间精密度为12.83%,分析灵敏度(检测低限)为8.03ug/L,试纸条稳定性盒在2～8℃环境里可存放12个月。其基本满足临床使用的要求。