前言;　　肿瘤的生长通常伴有新生血管的形成。因此阻断新生血管的形成尤其是靶向血管基因治疗已成为肿瘤治疗的发展方向之一。然而基因治疗成功的关键在于找到一种安全、操作简便、转染效率高的基因携带载体。近年来，超声联合微泡造影剂作为一种新型非病毒载体受到广泛关注。超声联合微泡造影剂增强基因转染的前提是不损伤组织和器官，因此合适的辐照条件是非常重要的，但目前尚无定论。　　KDR启动子-胸苷激酶自杀基因系统(KDR-TK)是由KDR启动子驱动的HSV-TK自杀基因系统。本研究通过裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，探讨不同超声机械指数(MI)、辐照时间及质粒浓度对体内基因转染效率的影响，优化超声联合SonoVue介导基因转染的体内实验条件，提高基因转染的效率。进一步明确在此最优实验条件下超声联合SonoVue介导KDR-TK基因转染治疗小鼠卵巢癌的有效性，为卵巢癌靶向血管基因治疗提供一种新的基因导入方法。　　材料与方法:　　1、利用人卵巢癌SK-OV-3细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型。　　将浓度为2×106/ml的细胞悬液按0.2ml/只接种于裸鼠右侧背部皮下，待成瘤后，选择肿瘤大小介于0.5cm左右的裸鼠以备实验所用。　　2、超声联合微泡造影剂介导GFP转染体内实验条件的优化　　将成瘤裸鼠33只，随机分成11组，每组3只。分别按MI为0.8、1.0、1.2、1.4;按照射时间为1 min、5min、10min、15min;按质粒浓度60μg、80μg、120μg进行超声辐照。辐照后48小时将裸鼠处死剥取瘤组织，使用流式细胞仪检测肿瘤内GFP转染效率;使用免疫荧光显微镜观察肿瘤内GFP荧光表达情况;HE染色观察裸鼠心、肝、脾、肺、肾组织学变化;检测裸鼠血清学尿素(UREA)、肌酐(CREA)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等指标。　　3、超声联合SonoVue介导KDR-TK基因转染治疗小鼠卵巢癌的有效性　　将成瘤裸鼠30只，随机分成5组，每组6只，A组，对照组加入PBS;B组，KDR-TK+PBS;C组，KDR-TK+ SonoVue;D组，KDR-TK+PBS+超声照射;E组，KDR-TK+SonoVue+超声照射。定期测量肿瘤大小计算抑瘤率，并每组选取3只裸鼠观察其生存时间;RT-PCR定量测量肿瘤内TKmRNA表达;抗CD34单抗免疫组织化学染色检测肿瘤微血管密度;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。　　4、统计学分析　　使用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)进行比较，LSD检验法作两两比较。生存分析采用Kaplan-Meier法，各组生存率的比较采用Log Rank法。　　结果:　　1、超声联合微泡造影剂介导GFP转染体内实验条件的优化　　(1)当MI为1.2时转染效率最高，与其余各组相比较有显著统计学意义(P＜0.001)，但是其余各组间比较无统计学差异(P＞0.05)。随着MI值的升高转染效率并没有增加。　　(2)当照射时间为10分钟时转染效率最高，与其余各组相比较有统计学意义(P＜0.05)，其余各组间比较无统计学差异(P＞0.05)。从1分钟到10分钟，随着辐照时间的延长，转染效率不断增加，当时间延长到15分钟时转染效率反而降低。　　(3)当质粒浓度为60μg时转染效率最高，与其余各组相比较有显著统计学意义(P＜0.01)，其余各组间比较无统计学差异(P＞0.05)。随着质粒浓度的升高转染效率没有增加。　　(4)当MI为1.2，辐照时间为10分钟，质粒浓度为60μg时肿瘤见较多明亮的绿色荧光，而其它条件下肿瘤内见少量绿色荧光。裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等其它器官组织内均无显著的荧光表达。　　(5)当机械指数达到1.4或辐照时间达到15min时，裸鼠血清ALT、AST值明显升高，血清UREA、CREA值则没有明显改变。其余各组血清ALT、AST、UREA、CREA值均没有改变。　　2、超声联合SonoVue介导KDR-TK基因转染小鼠卵巢癌的有效性　　(1)治疗对各组裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生长的影响　　C组(KDR-TK+SonoVue/GCV)、D组(KDR-TK+超声辐照/GCV)、E组(KDR-TK+SonoVue+超声辐照/GCV)肿瘤体积明显小于同期对照组(P＜0.001)，且E组肿瘤体积变化更明显;C组、D组、E组肿瘤生长受到抑制，E组较D组、C组抑瘤作用更明显，抑瘤率达到60.31％。　　(2) RT-PCR检测各组肿瘤细胞KDR-TK mRNA基因表达水平E组(KDR-TK+SonoVue+超声辐照/GCV)PCR扩增带亮度较强，D组(KDR-TK+超声辐照/GCV)和C组(KDR-TK+SonoVue/GCV)PCR扩增带亮度较弱，E组与D组、C组比较差异有显著性(P＜0.001)，D组、C组两组间比较差异有显著性(P＜0.001);而B组(KDR-TK)PCR扩增带亮度最弱，与以上各组比较差异均具有显著性(P＜0.001)。A组(PBS)未见PCR扩增带。B组与A组比较差异无显著性(P＞0.05)。　　(3)肿瘤微血管密度结果　　E组(KDR-TK+SonoVue+超声辐照/GCV)、D组(KDR-TK+超声辐照/GCV)、C组(KDR-TK+SonoVue/GCV)均能抑制肿瘤新生血管的生成，但是E组抑制肿瘤新生血管生成的作用强于D组、C组(P＜0.001)。　　(4) AI检测结果　　E组(KDR-TK+SonoVue+超声辐照/GCV)、D组(KDR-TK+超声辐照/GCV)、C组(KDR-TK+SonoVue/GCV)均能明显诱导肿瘤细胞凋亡，但是E组诱导细胞凋亡作用强于D组、C组(P＜0.001)。　　(5)荷瘤鼠生存时间分析　　C组(KDR-TK+SonoVue/GCV)、D组(KDR-TK+超声辐照/GCV)、E组(KDR-TK+SonoVue+超声辐照/GCV)裸鼠生存时间延长，与A组(PBS)、B组(KDR-TK)分别比较差异均具有显著性(P＜0.05);E组裸鼠生存时间明显延长，与C组比较差异具有显著性(P＜0.05)。但D组与E组比较差异无显著性(P＞0.05)。　　结论:　　1、超声介导SonoVue转染GFP体内转染最佳条件是:MI为1.2，辐照时间为10min，质粒浓度为60μg。　　2、超声联合SonoVue介导GFP体内转染具有较好的靶向性，而且本实验中最佳体内转染条件是安全的。　　3、超声联合SonoVue能够介导KDR-TK基因转染卵巢癌裸鼠皮下移植瘤，肿瘤内可见TKmRNA明显表达。　　4、超声联合SonoVue介导KDR-TK基因能够抑制肿瘤新生血管的生成，促进肿瘤细胞的凋亡，达到抑制肿瘤的生长，延长小鼠生存率的目的。