桑丁香假单胞菌稳产冠菌素关键技术的研究

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冠菌素是一种新型高效的生物源植物生长调节物质,喷施极低浓度的冠菌素,植物可获得更高的抗逆性和抗病性,具有广泛的应用前景。利用丁香假单胞菌发酵是工业化生产冠菌素有效途径之一,稳产高产冠菌素菌株是其前提。本文采用定量培养基技术对不同微生态环境下桑丁香假单胞菌密度分布进行了研究、采用重复序列PCR技术对不同生态型桑园桑丁香假单胞菌进行了分型研究和采用室温常压等离子体技术对产冠菌素菌株进行了诱变研究。结果认为,在对桑园桑丁香假单胞菌敏感的桑品种的桑树叶片组织中,可更有效地筛选到高产冠菌素野生菌株;利用室温常压等离子体突变技术,可获得稳产高产冠菌素突变体。研究结果对冠菌素规模化工业发酵奠定了基础。1)从桑树叶片组织中能更有效地分离获得高产冠菌素野生菌株。采用KBC选择性培养基对不同地区样品进行丁香假单孢菌野生菌株的筛选,对不同微生态环境下桑丁香假单胞菌密度分布进行了检测。结果表明,桑树叶片组织和桑园土壤中丁香假单胞菌的数量存在显著性差异,桑树叶片表现出较大的桑丁香假单胞菌种群生长密度,这与桑疫病发生过程中丁香假单胞菌分泌冠菌素来调控植物叶片气孔的侵染途径和方式有关。该结果为桑疫病爆发期间从桑树叶片组织中分离高产冠菌素的野生型丁香假单胞菌株找到了事实依据。2)水系丰富的桑园是筛选到高产冠菌素野生菌株最有潜力的目标源。以REP通用引物构建重复序列PCR技术,对本课题组菌种库中江浙一带筛选的产冠菌素野生菌株进行聚类分析和分型研究。结果表明,在相似系数为0.65时可将29株菌株分成5个类群,其中来自浙江淳安的桑树组织中假单胞菌类群的多样性程度高,可能与该地区水源充足的气候条件有关,由此推测出野生菌株多样性与地区水分条件可能具有一定的相关性,为后期筛选产冠菌素的桑丁香假单胞野生菌株提供了新思路。3)常压室温等离子体诱变技术获得高产稳产冠菌素的突变体菌株。对野生型出发菌株的冠菌素产能进行分析,发现在即使高温(32℃)下也能产冠菌素,但产量不稳定,且产冠菌素特性退化明显。采用常压室温等离子体诱变技术对出发菌株进行诱变,采取通用培养基培养。结果表明,冠菌素产量提高了5%;突变株经过10代传代培养后,冠菌素产量仍维持在稳定状态,变化幅度控制在2.24%之内,表现出工业化生产菌株的稳产特性。因此,常压室温等离子体诱变技术在保持出发菌株高产性质前提下有效地提高了菌株产量的稳定性,为冠菌素的工业化生产菌株的高效选育提供了一种新颖、有效的新技术。本文首次对生态型桑园微生态系统中桑丁香假单胞菌进行定量筛选,并将常压室温等离子体诱变技术应用于桑丁香假单胞菌的诱变,并对冠菌素产量提高机理进行了探讨,对冠菌素高产稳产关键技术进行了研究,对于工业化高产冠菌素菌株筛选和桑疫病监测预防具有重要的现实意义。
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