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研究目的:本研究旨在围绕前期研究中发现的、频发于胶质母细胞瘤的FGFR3-TACC3融合基因,重点探索该融合基因对应融合蛋白的翻译后水平调控机制,寻找针对FGFR3-TACC3融合蛋白的潜在治疗靶点,为临床治疗提供新的线索。本研究首先通过对FGFR3-TACC3蛋白组学数据分析,明确与FGFR3-TACC3融合蛋白相互作用的各类蛋白,筛选其关键互作蛋白;然后通过深入研究FGFR3-TACC3融合蛋白相关翻译后调控机制,探讨该调控机制在FGFR3-TACC3融合基因阳性胶质母细胞瘤发生发展中的作用;最后结合翻译后调控机制相关发现,探讨针对FGFR3-TACC3融合基因的治疗靶点及靶向治疗策略。研究方法:为了探索FGFR3-TACC3融合蛋白潜在的翻译后调控机制,首先在胶质母细胞瘤细胞U-251 MG中瞬时转染重组表达质粒（pc DNA3.1-HA-FGFR3-TACC3,pc DNA3.1-HA-FGFR3）并使用G418筛选稳定表达FGFR3-TACC3和FGFR3的细胞系。在获取稳定表达细胞系之后,利用免疫共沉淀及二维液相色谱串联质谱技术获取FGFR3-TACC3及野生型FGFR3蛋白组学数据,通过分析蛋白组学数据推测显著与FGFR3-TACC3融合蛋白相互作用的蛋白。运用免疫共沉淀反向验证FGFR3-TACC3蛋白组学结果,确定与FGFR3-TACC3融合蛋白相互作用的蛋白及关键翻译后调控机制。蛋白组学研究证实伴侣分子Hsp90、辅助伴侣分子Cdc37与FGFR3-TACC3形成三重复合体,提示Hsp90分子伴侣系统参与FGFR3-TACC3融合蛋白翻译后调控。为了深入研究Hsp90分子伴侣系统在FGFR3-TACC3融合蛋白翻译后调控中的作用,在稳定表达FGFR3-TACC3融合基因的胶质瘤细胞中分别应用Hsp90抑制剂onalespib、17-AAG和高效沉默Cdc37的小干扰RNA,然后运用免疫印迹法检测FGFR3-TACC3蛋白表达水平及磷酸化水平（Y647,Y648）变化。在Hsp90抑制剂处理下,分别通过流式细胞术以及膜蛋白分离术检测胶质母细胞瘤细胞膜FGFR3-TACC3蛋白水平表达变化。为了深入探讨Hsp90分子伴侣系统在FGFR3-TACC3融合蛋白翻译后调控机制,运用免疫印迹法和免疫共沉淀技术检测在Hsp90抑制剂作用下FGFR3-TACC3蛋白泛素化水平;运用蛋白合成抑制剂放线菌酮抑制蛋白质合成,观测在Hsp90抑制剂作用前后FGFR3-TACC3蛋白半衰期变化。为了探索Hsp90分子伴侣系统在FGFR3-TACC3融合基因阳性胶质母细胞瘤增殖中的作用,我们首先设立不同药物浓度,运用细胞增殖-毒性检测试剂盒检测方法检测一定药物浓度梯度下肿瘤细胞成活率,确定在Hsp90抑制剂处理下稳定表达FGFR3-TACC3融合基因的胶质母细胞瘤细胞的半抑制浓度;此外使用细胞集落形成实验计算集落形成率,来测定Hsp90抑制剂对FGFR3-TACC3融合基因阳性胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响。为了探索针对FGFR3-TACC3融合基因阳性胶质母细胞瘤的临床治疗手段,我们首先运用生物信息学分析技术对癌症图谱等公共癌症数据库进行分析,评估FGFR3-TACC3融合基因阳性胶质母细胞瘤对于烷化剂替莫唑胺的化疗敏感性。由于FGFR3-TACC3融合蛋白不仅保留了野生型FGFR3所有信号通路激活与转导结构域,还拥有更强的FGFR3信号通路活性,所以我们利用公共数据库分析FGFR3基因表达水平来推测FGFR3-TACC3融合基因与胶质母细胞瘤患者预后的关系。此外,我们又深入分析了FGFR3基因表达水平与烷化剂化疗敏感性关系。在体外实验部分,我们运用细胞增殖-毒性检测试剂盒检测方法以及细胞集落形成实验比较稳定表达FGFR3-TACC3、野生型FGFR3、激酶失活型FGFR3-TACC3和空载体的胶质母细胞瘤细胞对烷化剂替莫唑胺处理的敏感性差异。为了进一步探讨FGFR3-TACC3对烷化剂耐药相关机制,我们使用免疫印迹法检测稳定表达FGFR3-TACC3的胶质母细胞瘤细胞在长时间、高浓度替莫唑胺处理后相关信号通路的变化。此外,利用免疫印迹法、细胞免疫荧光染色检测脱氧核糖核酸损伤标志物p H2AX以评估稳定表达FGFR3-TACC3、野生型FGFR3、激酶失活型FGFR3-TACC3和空载体的胶质母细胞瘤细胞对烷化剂替莫唑胺处理的敏感性。为了探讨Hsp90抑制剂是否能通过抑制FGFR3-TACC3相关信号通路增加胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的敏感性,我们首先设立替莫唑胺和Hsp90抑制剂药物浓度矩阵,运用细胞增殖-毒性检测试剂盒检测方法检测肿瘤细胞成活率,最终运用混合药物分析软件Calcu Syn 2.0分析药物联合作用指数。然后运用免疫印迹法、细胞免疫荧光染色检测p H2AX来评估单一或联合运用替莫唑胺和Hsp90抑制剂对FGFR3-TACC3阳性胶质母细胞瘤细胞脱氧核糖核酸的损伤作用。体内实验部分,在立体定向仪辅助下使用稳定表达FGFR3-TACC3并感染了luciferase病毒的U-251 MG细胞建立裸鼠颅内肿瘤模型,其中实验组分别进行替莫唑胺灌胃（5mg/kg/day）、Hsp90抑制剂onalespib尾静脉注射（30mg/kg/day）以及二者联合应用,每天监测荷瘤裸鼠体重及存活情况,每7天使用活体荧光成像仪监测颅内肿瘤大小变化。根据荷瘤裸鼠健康状况选择是否处死,处死后取鼠脑切片以备后续免疫组化染色。研究结果:1.FGFR3-TACC3融合蛋白与Hsp90、Cdc37形成复合体,抑制Hsp90或Cdc37破坏整个复合体的形成。2.与野生型FGFR3相比,FGFR3-TACC3融合蛋白可结合更多的Hsp90、Cdc37。3.抑制Hsp90分子伴侣系统可抑制FGFR3-TACC3融合蛋白的糖基化修饰。4.抑制Hsp90分子伴侣系统可诱导糖基化修饰的FGFR3-TACC3融合蛋白泛素化降解从而导致其失活。5.FGFR3-TACC3是Hsp90强客户蛋白,强烈依赖Hsp90伴侣系统。6.应用Hsp90抑制剂onalespib、17-AAG可显著抑制稳定表达FGFR3-TACC3融合基因胶质母细胞瘤细胞增殖及集落形成能力。7.FGFR3-TACC3融合蛋白通过FGFR相关信号通路诱导胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺耐药。8.联合应用Hsp90抑制剂可提高FGFR3-TACC3融合基因阳性胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。研究结论:在Hsp90分子伴侣系统的协助下,新生的FGFR3-TACC3融合蛋白完成了包括糖基化在内的成熟过程。糖基化修饰的FGFR3-TACC3融合蛋白继续在Hsp90分子伴侣系统的保护下维持稳定性及磷酸化激活。靶向抑制Hsp90分子伴侣系统可阻碍FGFR3-TACC3融合蛋白的糖基化修饰过程并诱导糖基化修饰的FGFR3-TACC3融合蛋白泛素化降解。Hsp90抑制剂可显著抑制FGFR3-TACC3融合蛋白的磷酸化激活以及FGFR3-TACC3融合基因阳性胶质母细胞瘤细胞的增殖。联合应用Hsp90抑制剂可减弱FGFR3-TACC3融合基因阳性胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的耐药。