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背景:多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）是一种血液系统恶性疾病,其临床表现通常由单克隆蛋白、恶性浆细胞分泌的细胞因子以及骨髓、外周血和/或其他器官中的单克隆浆细胞浸润引起。MM细胞遗传学具有广泛的异质性,NRAS突变发生在大约20%的MM患者中,是一个驱动性突变,其Q61位密码子上因点突变而产生的错义突变最常见。研究表明,NRASQ61突变在MM的发生、发展、对治疗的反应以及对预后的影响中发挥重要作用,但其具体机制尚不明确。代谢改变是癌症的一个标志,其特征是多种代谢途径的重新编程。癌细胞中葡萄糖摄取显著增加的现象被称为“Warburg效应”。癌细胞在氧气存在的情况下发酵葡萄糖,称为有氧糖酵解。MM以骨髓中克隆浆细胞的积累为特征。由于浆细胞产生和分泌抗体的特殊功能及其有限的增殖能力,其对营养物质的吸收和生物分子的合成具有特殊的要求。MM细胞依赖糖酵解,也通过单羧酸转运蛋白1（monocarboxylate transporter 1,MCT1）吸收外源性乳酸来为氧化磷酸化（oxidative phosphorylation,OXPHOS）提供能量。此外,将乳酸转化为丙酮酸的乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A,LDHA）在MM细胞中高度表达。当MM细胞中糖酵解受到限制时,OXPHOS可以进行代偿。MM细胞与正常浆细胞在能量代谢方面存在差异,但NRASQ61突变对MM细胞代谢的影响尚不明确。PI3K-Akt和RAF-MEK-ERK是NRAS激活的两条主要通路。PI3K-Akt通路不仅促进葡萄糖摄取的增加,而且促进糖酵解途径进展。RAF-MEK-ERK途径的激活通过诱导与糖酵解、TCA循环和大分子生物合成有关的转录调节因子的激活促进有氧糖酵解表型。糖酵解能通过抑制细胞凋亡、诱导上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）、诱导自噬、抑制药物流入和增强药物流出诱导耐药。本研究通过构建表达NRASQ61突变的骨髓瘤细胞模型,对NRASQ61突变对骨髓瘤细胞下游信号、增殖、耐药及代谢的影响及机制进行探索,并以糖酵解为基础,为治疗MM提供新的思路和策略。目的:1.构建NRAS过表达、表达野生型NRAS、表达NRASQ61H、NRASQ61R、NRASQ61K的MM细胞模型,在此基础上探索NRAS过表达及Q61突变对下游信号、细胞增殖、凋亡、耐药的影响;2.明确NRAS过表达及Q61突变对MM细胞代谢的影响;3.探索NRASQ61突变对代谢影响的具体机制以期发现潜在的药物靶点。方法:1.应用Western Blot法检测MM细胞株中NRAS及其下游信号p-ERK/2的表达水平;2.采用定点突变PCR、载体双酶切及慢病毒转染技术构建表达NRASQ61H、NRASQ61R、NRASQ61K、NRASWT及过表达NRAS的多发性骨髓瘤细胞模型;3.应用Western Blot及q-PCR技术检测NRASQ61H、NRASQ61R、NRASQ61K、NRASWT及过表达NRAS的多发性骨髓瘤细胞中主要下游信号、凋亡相关蛋白及与MM代谢、增殖相关转录因子c-Myc、IRF4的表达;4.利用流式细胞术检测经蛋白酶体抑制剂硼替佐米、RAF抑制剂达拉非尼、MEK抑制剂比美替尼、硼替佐米联合达拉非尼或比美替尼处理后,NRAS过表达及Q61突变骨髓瘤细胞的凋亡比率;5.利用Western Blot技术检测NRAS Q61突变骨髓瘤细胞经硼替佐米、达拉非尼、比美替尼、硼替佐米联合达拉非尼或比美替尼处理后,RAF-MEK-ERK信号途径磷酸化蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平;6.应用流式细胞术检测上述细胞系在不同营养条件下的凋亡比率;7.利用Agilent Seahorse XF能量代谢检测技术检测上述细胞系糖酵解能力及氧化磷酸化水平;8.采用转录组测序技术对糖酵解水平明显升高的NRASQ61K突变骨髓瘤细胞进行转录组测序,并与表达野生型NRAS的骨髓瘤细胞进行显著差异基因分析;9.利用sh RNA技术敲减NRASQ61K突变骨髓瘤细胞中显著上调的基因,进一步检测其代谢改变及对硼替佐米的反应;10.利用Western Blot技术检测基因敲减后,NRASQ61K突变骨髓瘤细胞中与糖酵解相关的蛋白及转录因子的表达水平。结果:1.成功构建过表达NRAS及表达NRASQ61H、NRASQ61R、NRASQ61K及表达NRASWT的多发性骨髓瘤细胞模型;2.NRAS的Q61H、Q61R、Q61K突变在不同遗传背景下引起不同的信号通路激活,在BM细胞中主要介导RAF-MEK-ERK通路的激活,而在OPM2中主要介导PI3K-AKT-m TOR通路的激活;3.NRAS Q61突变引起骨髓瘤细胞中c-Myc及IRF4下调;4.NRAS Q61突变不增加骨髓瘤细胞的增殖速率;5.NRAS过表达及Q61突变导致骨髓瘤BM细胞对硼替佐米耐药,硼替佐米联合RAF抑制剂/MEK抑制剂不能逆转耐药性;6.NRASQ61突变介导的BTZ耐药与Bim有关,但Bim不参与MEK抑制剂与BTZ的协同作用;7.NRASQ61突变,尤其是Q61K,削弱了骨髓瘤BM细胞对葡萄糖剥夺的抵抗及对酸性肿瘤微环境的抵抗力,增加了骨髓瘤细胞糖酵解能力;8.NRAS过表达及Q61突变增加了骨髓瘤BM细胞氧化磷酸化水平;9.NRASQ61K突变骨髓瘤BM细胞中LAPTM5转录及表达显著上调;10.LAPTM5敲减诱导NRASQ61K突变骨髓瘤BM细胞对葡萄糖剥夺抵抗力增加,糖酵解能力下降;11.LAPTM5敲减NRASQ61K突变骨髓瘤BM细胞部分逆转对硼替佐米的抵抗;12.LAPTM5敲减NRASQ61K突变骨髓瘤BM细胞糖酵解能力下降可能与p-m TOR、c-Myc表达下调有关。结论:1.NRASQ61突变在不同遗传背景下激活不同的下游通路;2.NRASQ61突变介导骨髓瘤BM细胞对硼替佐米耐药,机制与Bim下调有关;3.NRASQ61突变,尤其是Q61K,诱导骨髓瘤细胞糖酵解显著增强,并增加氧化磷酸化,提示NRAS突变导致骨髓瘤细胞对能量的需求急剧增加;4.NARSQ61K突变在转录水平上显著上调骨髓瘤细胞中LAPTM5表达;5.敲减LAPTM5降低NRAS突变骨髓瘤细胞糖酵解和氧化磷酸化水平,可能与c-myc及p-m TOR表达下调有关,并部分逆转骨髓瘤细胞耐药。