猴头菌Hericium erinaceus是著名的药食兼用菌,其性平、味甘、入药利五脏、助消化,临床上用于治疗神经衰弱、胃炎及胃溃疡等消化系统的疾病和肿瘤。真菌的生长发育是一个复杂的生命过程,不同生长发育阶段涉及到新陈代谢、激素调控、营养物质合成及转运、细胞分裂及分化、信号转导等多个代谢途径的协同调控。多糖的生物活性与多糖含量、分子量分布及化学组成等理化性质有关,同时这些理化性质与子实体的发育关系显著。本论文从多糖的理化特征及免疫活性两个方面入手,针对猴头菌栽培过程中不同发育阶段子实体胞内和胞壁多糖的动态变化规律进行研究,为猴头菌的采收及栽培提供理论基础。针对成熟期子实体中的大分子均一多糖进行了结构鉴定及免疫活性研究,为其构效关系的进一步研究奠定基础。具体研究内容分为以下几部分:1、猴头菌不同发育阶段胞内多糖的理化性质及体外免疫活性。对猴头菌0605菌株进行栽培,采收了7个发育阶段(现蕾期、无菌刺期、分裂期、小菌刺期、中菌刺期、成熟期、成熟后期)的猴头菌子实体鲜菇,通过分析可溶性固形物含量对分级醇沉多糖的理化性质及体外免疫活性的影响,发现实际生产中可通过控制浓缩液中可溶性固形物含量和低浓度醇沉来获得活性好的猴头菌多糖。猴头菌7个不同发育阶段的子实体,经热水浸提后分别采用20%、50%、70%的乙醇终浓度进行分级沉淀,获得21个多糖组分,对其理化性质及体外免疫活性研究表明,猴头菌发育过程中,多糖总得率呈现先增大后减小的趋势,第5阶段达到最大值0.92%。20%醇沉多糖含量也呈先增大后减小的趋势,在第5阶段达到最大值42.87%,其大分子量多糖(100?500万道尔顿)所占比例最高。50%、70%醇沉多糖均为小分子量多糖,约为1?4万道尔顿。获得的猴头菌多糖组分中,单糖组成多以岩藻糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖为主(相对比例存在一定差异);另外,第1阶段20%、70%醇沉多糖还含有少量的核糖,第7阶段20%醇沉多糖含有一定量的鼠李糖;7个时期50%醇沉多糖均含有一定量的葡萄糖醛酸。所得多糖样品均具有刺激巨噬细胞释放NO的活性,其中20%醇沉多糖的活性优于50%和70%醇沉多糖,在50μg/m L时就表现出显著的体外免疫活性。第5阶段即中菌刺期产生的多糖活性最优,说明在此阶段采摘有利于获得高活性的猴头菌多糖。本研究为猴头菌生长发育过程中活性多糖的动态变化研究提供了一定的理论基础。2、猴头菌不同发育阶段细胞壁多糖的理化性质及体外免疫活性。以猴头菌子实体残渣为试验材料,研究了残渣粉粹时间及提取用溶剂对其细胞壁多糖提取得率和结构特征的影响。研究发现粉碎时间延长可增加水溶性细胞壁多糖的得率,但多糖含量会降低,粉粹时间对水溶性细胞壁多糖的分子量分布及单糖组成影响较大,最佳粉碎时间为15min。Na OH浓度的增加可提高碱溶性细胞壁多糖的得率和含量,但免疫活性降低,最适的Na OH浓度为0.5mol/L。粉碎水提、碱提两种方式得到的细胞壁多糖均能够显著刺激小鼠巨噬细胞释放NO,具有较好的体外免疫活性;比较水溶性细胞壁多糖与碱溶性细胞壁多糖的结构差异,发现水溶性细胞壁多糖分子量远大于碱溶性细胞壁多糖。碱溶性细胞壁多糖只含有葡萄糖,而水溶性细胞壁多糖还含有一定量的半乳糖,且葡萄糖与半乳糖之间的比值约为4:1。对7个发育阶段的猴头菌残渣完成粉碎水提和碱提,提取液通过浓缩、70%的乙醇醇沉、透析,分别获得水溶性及碱溶性细胞壁多糖,对它们的理化性质及体外免疫活性进行研究。结果表明不同发育阶段水溶性细胞壁多糖得率及含量均呈先增大后减小趋势,第7阶段得率最低为2.04%,多糖含量第3阶段最大73.73%,分子量在1000万道尔顿和30?90万道尔顿之间,分子量1000万道尔顿多糖所占比例先增大后减小,第5阶段最大;分子量在30?90万道尔顿左右,第1、2、6、7阶段多糖所占比例明显高于其他阶段。碱溶性细胞壁多糖得率也呈现先升高后降低的趋势,第6阶段最高3.50%,第7阶段多糖得率最低为2.20%,第3阶段多糖含量最高为74.19%。分子量主要集中在200万道尔顿,不同生长发育期此部分多糖所占比例先升高后降低,第5阶段中菌刺期最高。碱溶性细胞壁多糖的单糖组成只含有葡萄糖,而水溶性细胞壁多糖主要由葡萄糖和半乳糖组成。水溶性与碱溶性细胞壁多糖均具有较好的生物活性,在低浓度50μg/m L,水溶性细胞壁多糖活性较碱溶性细胞壁多糖好。反之,在高浓度500μg/m L时碱溶性细胞壁多糖活性更好。总的来说,第4阶段即小菌刺期细胞壁多糖活性最优。3、猴头菌大分子多糖的分离纯化、结构鉴定及免疫调节作用成熟期猴头菌经沸水提取,低温静置,高速离心,低浓度乙醇反复醇洗,获得大分子均一多糖H6PC20。多糖得率为0.25%,多糖含量为90.99%,重均分子量为2.39×106Da。单糖组成结果表明H6PC20是一个葡聚糖,通过红外光谱、甲基化和核磁共振联用分析,得出H6PC20是由1,3-β-linked Glcp组成,并带有1,6-β-linked Glcp连接的侧链,通过O-6位与主链相连,一级结构重复单元为:H6PC20能够显著刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO,刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖,H6PC20和丝裂原共同作用对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响表明,H6PC20具有T淋巴细胞有丝分裂原的性质,能够明显促进T淋巴细胞的分裂增殖,调节机体免疫反应。