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研究目的和背景前期我们课题组发现,SATTB2上调后的结直肠癌细胞其增殖、运动侵袭能力明显受抑;microRNA芯片检测的结果表明,上调结直肠癌细胞株SATB2表达后有2种microRNA上调、20种microRNA下调。我们选取了下调差异较为显著的miR202作为我们的兴趣microRNA,并对其标靶蛋白做了进一步预测。结果显示,参与小分子RNA调控的关键酶Dicer是miR202的靶标蛋白之一。miRNA是一类非编码的、内源性小RNA片段,长约20～25个核苷酸。由miRNA介导的基因转录后调控是基因表达调控的重要方式之一。在哺乳动物,Dicer是miRNA合成的关键因子。近年越来越多的证据表明,Dicer与肿瘤发生、发展有关。Karube等检测了 67例非小细胞肺癌样品中Dicer和DROSHA的RNA表达水平,发现Dicer的表达量下降与术后存活期缩短相关;在卵巢癌及乳腺癌中也观察到存在Dicer的表达下调。这些结果提示Dicer是一个潜在的抑癌基因。然而,在前列腺中的研究发现,Dicer蛋白在前列腺癌组织中的表达水平明显高于良性及正常的前列腺组织,而且其表达与肿瘤的分型、分期和肿瘤侵袭性本身密切相关,高表达Dicer的前列腺癌更容易扩散、复发。结直肠癌组织Dicer表达越高,患者预后相对越差;而Dicer的表达与结直肠癌分型、分化无明显关系。最新的研究表明,Dicer与肿瘤转移相关,Dicer表达下调可使得癌细胞获得干性及发生上皮间质转化。但是Dicer在结直肠癌中的作用还有许多的疑问待阐明,它是抑癌基因还是促癌基因呢?特别是在整体水平上Dicer在结直肠癌发生发展中的作用如何仍缺乏证据。研究方法1、Dicer在临床结直肠癌mRNA、蛋白表达水平检测及相关分析(1)应用68例临床结直肠癌配对组织标本,运用逆转录—荧光定量PCR技术分析Dicer mRNA表达情况,并与患者的临床特征及Dukes分期进行相关性分析,初步确定Dicer与结直肠癌患者临床病理特性之间的关系;另与肿瘤干细胞相关基因Nanog、Oct4、Lin28B、Axin、CD24及SATB2基因mRNA水平表达情况进行相关性分析,进步一了解Dicer与结直肠癌细胞“干性”之间的联系。(2)通过Western blot检测检测临床结直肠癌与正常组织Dicer蛋白表达情况,同时应用免疫组织化学检测不同分化程度及预后的结直肠癌组织Dicer蛋白表达水平。此外,通过免疫荧光技术对结直肠癌组织Dicer表达定位进行分析。2、Dicer瞬时干扰及稳定敲除后对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响。(1)根据文献及NCBI资料(http://cgap.nci.nih.gov/RNAi)及Invitrogen网上软件设计Dicer特异性的siRNA干扰片断,转染SW480、HCT116细胞,并通过Western blot验证;Dicer稳定敲除的DLD1、HCT116及RKO细胞亚系由The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center and Howard Hughes Medical Institute 的 Bert Vogelstein教授惠赠。(2)应用CCK-8细胞增殖测定、平板克隆形成实验、Transwell小室迁移实验和FN异质粘附实验观察Dicer干扰及稳定敲除后对结直肠癌细胞的体外增殖、迁徙及粘附能力的影响。(3)通过皮下注射Dicer稳定敲除后的结直肠癌细胞,观察其裸鼠皮下成瘤情况。3、AOM诱导肠粘膜上皮条件性Dicer敲除小鼠的肠肿瘤模型的建立(1)应用含有LoxP序列的Dicerloxp/loxp小鼠与含有肠粘膜上皮特定Villin启动子驱动的Cre重组酶小鼠进行数代的杂交,获得肠粘膜上皮条件性Dicer敲除小鼠(Dicerloxp/loxp&Villin-Cre)。(2)经培育观察所得野生型小鼠(Dicerloxp/loxp)、Dicer杂合缺失型小鼠(Dicerloxp/+&Villin-Cre)和Dicer纯和缺失型小鼠(Dicerloxp/loxp&Villin-Cre)的生长、发育及生存等相关情况。应用AOM诱导剂(10mg/kg)腹腔注射野生型小鼠、Dicer杂合缺失型小鼠和Dicer纯和缺失型小鼠,对比三种小鼠结直肠成瘤情况。结果1、Dicer在临床结直肠癌mRNA、蛋白表达水平检测及相关分析1.1荧光定量PCR分析68例临床结直肠癌标本癌组织与正常粘膜组织中DicermRNA水平的表达情况。结果显示,Dicer在77%(52/68)肿瘤组中的mRNA低于正常粘膜组,具显著性差异(t=-4.043,P<0.01);此外,应用Bivariate双变量相关分析对68例结直肠癌组织标本Dicer与SATB2、干细胞相关基因mRNA表达水平进行分析发现:Dicer的表达与Nanog、Oct4、Lin28B、Axin、CD24及 SATB2 的表达显著相关(分别为 r=0.584,P<0.001;r=0.44,[<0.001;r=0.362,P=0.003;r=0.664,P<0.001;r=0.444,P<0.001)。进一步分析结直肠癌组织Dicer mRNA表达水平与患者年龄、性别及临床病理特征的关系,结果均无统计学意义。1.2 Western-blot结果显示,临床结直肠癌组织Dicer蛋白水平表达明显低于相对正常组织;免疫组织化学结果进一步表明,Dicer表达与临床结直肠癌分化相关,相对低分化的结直肠癌组织Dicer表达越弱(P=0.041)。免疫荧光结果显示,Dicer表达定位在胞浆。2、Dicer干扰及稳定敲除后对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响。2.2 CCK-8细胞增殖结果显示,Dicer干扰后的SW480细胞和稳定敲除后的DLD1、HCT116及RKO结直肠癌细胞较对照组的体外增殖能力均降低,差异具有统计学意义(SW480/SW480siDicer:F=14.766P<0.001;DLD1/DLD1 Dicer-/-:F=55.416 P=0.026;HCT116/HCT116 Dicer-/-:F=153.658 P<0.001;RKO/RKO Dicer-/-:F=47.298P<0.001)而HCT116/siDicer细胞增殖较对照组无明显改变,差异无统计学意义(HCT116/HCT116siDicer:F=1.321P=0.255)。2.3平板克隆实验显示,Dicer干扰及稳定敲除后的结直肠细胞体外克隆形成率较对照组均降低,差异具有统计学意义(SW480/SW480siDicer:t= 2.802 P=0.049;HCT116/HCT116siDicer:t=14.186 P<0.01;DLD1/DLD1 Dicer-/-:t=4.117 P=0.001;HCT116/HCT116 Dicer-/-:t=4.632 P=0.01;RKO/RKO Dicer-/-:t=10.669 P<0.001)。2.4 Transwell小室迁移实验显示,Dicer干扰及敲除后的结直肠癌细胞的迁移能力明显低于相应的对照组,差异具有统计学意义(SW480/SW480siDicer:t=2.839 P=0.011;HCT116/HCT116siDicer:t=5.297 P<0.01;DLD1/DLD1 Dicer-/-:t=6.297P=<0.01;HCT116/HCT116 Dicer-/-:t=6.307 P<0.01;RKO/RKO Dicer-/-:t=5.031P<0.01)。2.5纤维蛋白(FN)异质粘附实验结果显示,Dicer干扰及稳定敲除后的结直肠癌细胞的异质粘附能力明显低于相应的对照组,差异具有统计学意义。(SW480/SW480siDicer:t= 4.333 P=0.001;HCT116/HCT116siDicer:t=4.445 P=0.001;DLD1/DLD1 Dicer-/-:t=11.228 P<0.01;HCT116/HCT116 Dicer-/-:t=2.825 P=0.01;RKO/RKO Dicer-/-:t=34.189 P<0.01)。2.6裸鼠皮下成瘤实验结果显示,Dicer稳定敲除后的DLD1、HCT116及RKO结直肠癌细胞的体内增殖能力明显低于相应的对照组,差异具有统计学意义(DLD1/DLD1 Dicer-/-:F=17.293 P<0.01;HCT116/HCT116 Dicer-/-:F=14.812 P=0.001 及RKO/RKO Dicer-/-:F=8.906 P=0.005)3、AOM诱导肠粘膜上皮条件性Dicer敲除小鼠的肠肿瘤模型3.1将Dicerloxp/loxp小鼠与Villin-Cre重组酶小鼠进行数代的杂交后,经组织提取DNA检测Dicer-loxp及Cre基因(Dicerloxp/loxp小鼠仅出现一个420bp条带;Dicerloxp/+小鼠可出现420bp和351bp两条条带;野生型(WT)小鼠则只出现一条351bp条带;表达Cre的小鼠可以出现一条350bp的条带,而野生型不出现条带,总体所得各基因小鼠结果符合孟德尔遗传规律。3.2通过连续6月观察发现,Dicer纯和缺失小鼠生长能力明显低于同窝其它基因型鼠,差异具显著性(F=144.748,P<0.01);然而Dicer杂合缺失小鼠与WT小鼠生长无明显差(P=0.694)。生存分析结果提示,Dicer纯和缺失小鼠生存时间短于Dicer杂合缺失小鼠与WT小鼠,差异具有显著性(分别为χ2=26.401,P<0.01;χ2=46.509,P<0.01)而Dicer杂合缺失小鼠与WT小鼠生存时间无明显差异(χ2=0.033,P=0.856)。常规组织学HE染色发现,出生5天的Dicerloxp/loxp&Villin-Cre小鼠小肠粘膜溃疡缺损,间质较多炎细胞浸润;存活9周的Dicerloxp/loxp&Villin-Cre小鼠,大体可发现大肠部分局部组织粗糙明显增厚,常规组织学HE染色显示,大肠部分粘膜脱落缺损,广泛粘膜下纤维增生明显,伴较多炎细胞浸润;而同窝出生野生型小鼠大肠和小肠粘膜未见明显异常。3.3 AOM诱导满6月后,我们发现与野生型小鼠相比较,Dicerloxp/+&Villin-Cre小鼠结直肠粘膜异常隐窝灶(aberrant crypt foci,ACF)增多。更为重要的是,其中两例AOM诱导满6月后的Dicer杂合缺失型小鼠(Dicerloxp/+&Villin-Cre)结肠粘膜发现浸润性癌的改变。一例结肠可见瘤组织排列成大小不等腺腔样结构,部分形成筛网状结构,细胞核大深染,具有较明显的异型性,浸润性生长;一例肠壁平滑肌间淋巴管内可见浸润的肿瘤组织,瘤组织排列成大小不等的筛网状结构,细胞核大深染,具有较明显的异型性。结论:1、结直肠癌组织中Dicer表达低于正常组织,同时其表达的高低与结直肠癌分化程度相关。2、结直肠癌细胞Dicer瞬时干扰和稳定敲除后体外增殖、粘附、迁移能力及裸鼠皮下瘤细胞接种生长能力较对照组均明显降低。3、肠粘膜上皮条件性Dicer纯和敲除小鼠的生长、发育明显受抑,其肠粘膜较野生型小鼠有明显的炎症反应;AOM可诱导肠粘膜上皮条件性Dicer杂合敲除小鼠发生浸润性癌。