目的研究益气逐瘀解毒颗粒抗肝纤维化作用的机制与Th17/Treg细胞平衡的相关性。方法123只SPF级SD雄性大鼠,体重(160±20)g,适应性喂养一周,称重后随机分为2组:模型组和空白对照组,模型组采取腹部或背部皮下注射CCL4橄榄油混合液(按2:3比例配制)方式造模7周,每周注射2次,待肝纤维化模型制备成功后,将模型组大鼠随机分为益气逐瘀解毒颗粒高、中、低剂量组、阳性对照组(扶正化瘀组)、模型对照组,空白对照组不变。益气逐瘀解毒颗粒高、中、低剂量治疗组分别予以益气逐瘀解毒颗粒高、中、低剂量灌胃治疗,阳性对照组采用扶正化瘀胶囊灌胃治疗,模型对照组和空白对照组以等体积蒸馏水灌胃,灌胃治疗5周后处死所有大鼠,取血液、肝脏、脾脏标本。观察指标:(1)采用HE、MASSON染色检测肝细胞损伤程度与肝纤维化病理学指标;(2)采用全自动生化分析仪检测ALT、AST、γ-GT肝功能指标;(3)ELISA法测定血清HA、LN、IL-17水平;(4)RT-PCR检测大鼠肝组织中MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、Col1A1、Col1A2、TGF-β1、Fox P3、RORγt及IL-17表达;(5)免疫组化法检测肝组织中α-SMA表达;(6)应用流式细胞术检测各组大鼠脾脏中Th17细胞、Treg细胞表达。结果1.肝纤维化大鼠模型制备结果(1)大鼠一般情况:除空白对照组外,模型组大鼠体重减轻,精神萎靡不振,疲倦、乏力,反应慢,行动迟缓且常扎堆蜷缩于鼠笼角落,食量、饮水量明显减小,大便偏稀,小便色黄、有少量白色分泌物,毛发粗糙脱落、无光泽,注射部位皮肤脱落、溃烂明显,个别大鼠偶有眼角部位出血情况,造模过程中大鼠有死亡情况发生。(2)肝脏标本大体观察:7周造模结束后肝标本色暗、无光泽,边缘变钝,形态整体萎缩变小,质地硬,表面颗粒样凸起明显。(3)模型组大鼠肝脏标本病理检测结果:肝细胞轻度水肿,空泡性脂肪变性明显,汇管区明显扩大,胶原纤维不规则增生、增粗并且沉积区域明显增宽,有纤维间隔形成,并且向中央静脉和汇管区周围不断延伸,分割肝小叶,有假小叶形成的趋势,其肝纤维化分级已达到3级或3级以上,少数大鼠有少量假小叶形成。2.益气逐瘀解毒颗粒治疗效果(1)大鼠一般情况:大鼠体重明显增加,精神状态较前明显好转,疲倦、乏力症状较前好转,活动量增大,摄食量增加,毛发粗糙脱落、色泽较前改善,注射部位皮肤脱落、溃烂面积逐渐缩小、愈合,小便色黄,大便呈黑褐色,稍稀,因灌胃操作不慎导致大鼠死亡2只,无其他特殊死亡情况发生。(2)肝脏标本大体观察:整体来说,中药各剂量组肝脏表面光滑,色暗红,有光泽,质软,边缘稍钝。中、低剂量组有1-2个肝标本形态变小,色暗红,表面有细小颗粒;扶正化瘀组大多数肝脏表面光滑,色暗红,有光泽,肝缘钝,少数肝脏形态变小,表面有细小颗粒感;模型对照组肝脏形态萎缩变小,色暗红,无光泽,质地硬,肝缘钝,少数肝脏表面呈花斑样改变,边缘有细小颗粒样凸起;空白对照组肝脏色鲜红,有光泽,表面光滑,质地柔软,边缘锐利,大小正常。(3)肝标本病理指标检测结果:空白对照组肝小叶结构清晰,未见胶原纤维增生,未见纤维间隔及假小叶形成;模型对照组胶原纤维不规则增生增粗,沉积区域明显增宽,纤维间隔增多,个别动物有假小叶形成;与模型对照组相比,药物治疗组胶原纤维含量较少,纤维化程度轻。中药高剂量组增生的胶原纤维仅局限于汇管区,无纤维间隔形成;中药中、低剂量组肝小叶结构紊乱,可见较短、较细的纤维间隔向周围肝小叶内延伸,有纤维间隔形成;扶正化瘀组多数肝小叶结构正常,仅有少数动物出现纤维间隔增粗增宽,有假小叶形成。MASSON染色半定量评分结果显示中药高剂量组较模型对照组评分明显降低,纤维化程度低。(4)生化指标(ALT、AST、γ-GT)检测结果:各组肝功能指标均在正常参考值范围。与空白对照组相比,模型对照组AST、ALT、γ-GT水平明显升高(p﹤0.05);与模型对照组相比,中药高剂量组AST、ALT、γ-GT的水平明显降低(p﹤0.05)。(5)ELISA法测定血清中HA、LN、IL-17水平结果:(1)HA:因所测OD值偏小,其浓度偏低,个体之间差异大,经排除后无法进行统计,待后续重复实验再次验证;(2)LN:与空白对照组相比,模型对照组LN水平明显升高(p﹤0.01);与模型对照组相比,药物治疗组LN水平明显降低(p﹤0.05);与阳性对照组相比,中药低剂量组LN水平明显降低(p﹤0.05);(3)IL-17:因所测OD值偏小,其浓度偏低,个体之间差异大,经排除后无法进行统计,待后续重复实验再次验证。(6)RT-PCR检测肝组织中MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、Col1A1、Col1A2、TGF-β1、Fox P3、RORγt及IL-17表达结果:(1)MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1:与空白对照组相比,模型对照组MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表达量明显降低(p﹤0.05),TIMP-1表达量明显升高(p﹤0.05);与模型对照组相比,中药高剂量组MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表达量明显升高(p﹤0.05),TIMP-1表达量明显降低(p﹤0.05);(2)Col1A1、Col1A2、TGF-β1:与空白对照组相比,模型对照组Col1A1、Col1A2、TGF-β1表达量明显升高(p﹤0.05),与模型对照组相比,中药高剂量组Col1A1、Col1A2、TGF-β1表达量明显降低(p﹤0.05);(3)Fox P3、RORγt、IL-17:与空白对照组相比,模型对照组Fox P3、RORγt、IL-17表达量明显升高(p﹤0.05);与模型对照组相比,药物治疗组Fox P3、RORγt、IL-17表达量明显降低(p﹤0.05)。(7)免疫组化法检测肝组织中α-SMA表达结果:α-SMA为HSCs活化的标记,阳性染色区域主要分布在汇管区、纤维间隔,其余部位弥散性分布。与空白对照组相比,模型对照组α-SMA表达量明显升高(p﹤0.01);与模型对照组相比,药物治疗组α-SMA表达量明显降低(p﹤0.01);与阳性对照组相比,高、中剂量组α-SMA表达量明显降低(p﹤0.01)。(8)流式细胞术检测各组大鼠脾脏中Th17细胞、Treg细胞的表达结果:(1)Th17细胞占CD4+T细胞的百分率:与空白对照组相比,模型对照组明显升高(p﹤0.05);与模型对照组相比,中药高、中剂量组及扶正化瘀组降低,但差异不显著,无统计学意义(p﹥0.05);(2)Treg细胞占CD4+T细胞的百分率:与空白对照组相比,模型对照组明显升高(p﹤0.05);与模型对照组相比,药物治疗组均降低(p﹤0.05),以中药各剂量组尤为突出(p﹤0.01)。结论1.采取腹部或背部皮下注射CCL4橄榄油混合液方式成功制备肝纤维化大鼠模型;2.益气逐瘀解毒颗粒具有明显的抗肝纤维化作用;3.益气逐瘀解毒颗粒抗肝纤维化作用与抑制HSCs活化、调控MMPs与TIMPs平衡有关;4.益气逐瘀解毒颗粒可能通过调控Th17、Treg细胞的表达发挥抗肝纤维化作用。