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原发性肝细胞癌伴胆管癌栓（Hepatocellular carcinoma with bile duct tumorthrombi，HCCBDT）是肝细胞癌的一种亚型，其恶性程度高，总体疗效差，生物学特性与不伴胆管癌栓的肝细胞癌有较大差异，表现为更强的侵袭和转移能力，术后短期内肝内复发和转移率高。我国每年HCCBDT新发病例约为5000～38700人，且有逐年上升趋势。目前HCCBDT患者的预后较差，其1、3、5年生存率分别约为：40-70%、20-50%、10-30%，明显差于不伴有癌栓的肝癌患者。HCCBDT预后不佳的原因可能主要为以下两点：1、HCCBDT缺少特异性的血清学标志物，癌栓存在于胆管细小分支内时，易漏诊，从而导致了相当一部分患者错过根治性手术机会。2、HCCBDT肿瘤细胞具有较强的侵袭能力和转移能力，术后早期复发和肝内转移率高，缺乏有效的防治方法。本课题前期研究发现肝癌胆管癌栓和原发灶之间部分基因存在着表达差异，并将这些基因与肝癌伴胆管癌栓手术患者临床资料相结合，从中找出了三个差异比较明显、且文献报道与肿瘤预后相关的基因：AQP5、CCL20及NDRG2，进行进一步的研究。第一部分： AQP5在原发性肝细胞癌伴胆管癌栓中的表达意义及功能AQP5是水通道蛋白（aquaporin）大家族中的一员，文献报道AQP5与乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、慢性粒细胞性白血病等多种恶性疾病的发生发展相关，且其表达水平的升高能促进肿瘤细胞的增殖及侵袭转移。本研究在5例患者新鲜标本行Real-time PCR检测AQP5mRNA水平，发现癌栓组织中明显强于癌组织（P=0.027），且在有相应癌旁组织的3例标本中检测结果提示，同一患者中AQP5mRNA表达水平：癌栓＞癌＞癌旁，但无统计学意义（P=0.064）。通过免疫组化在84例患者的组织切片检测AQP5的表达水平，发现AQP5在肝癌组织中的表达明显强于癌旁组织，（P＜0.001）；同一患者中AQP5表达水平：癌栓＞癌＞癌旁（P＜0.001）。临床资料分析提示：AQP5表达水平是HCCBDT患者总体生存时间的独立危险因素，其相对危险度为1.366。本课题通过对肝癌细胞系Huh7、HepG2及PVTT转染siRNA-AQP5干扰细胞AQP5的表达。以siRNA-AQP5组为干扰组，siRNA-N组为对照组。与对照组相比，三个细胞系中干扰组AQP5基因的mRNA及蛋白表达水平均明显下降，且同时伴有MMP2、MMP9、ERK1/2的表达水平下降。通过MTT细胞增殖实验、细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验比较两组细胞的增殖及侵袭能力发现，干扰AQP5的基因表达，可使上述三个细胞系细胞的增殖及侵袭能力明显下降。第二部分：CCL20在原发性肝细胞癌伴胆管癌栓中的表达意义及功能CCL20是趋化因子家族中的重要成员之一，属于CC亚族，其受体为CCR6。CCL20在被激活的单核细胞、T细胞、树突状细胞及内皮细胞中表达，其受体CCR6主要在肝、肺及淋巴组织中表达。CCL20的表达可被肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素1β（IL-1β）、白介素17（IL-17）、CD40配体及干扰素γ（IFN-γ）等细胞因子诱导，在恶性肿瘤的生长及促进肿瘤细胞的侵袭转移（主要是肝内转移）中发挥重要的作用。本研究在5例患者新鲜标本行Real-time PCR检测CCL20mRNA水平，发现癌栓组织中明显强于癌组织（P=0.048），且在有相应癌旁组织的3例标本中检测结果提示，同一患者中CCL20mRNA表达水平：癌栓＞癌＞癌旁（P=0.048）。通过免疫组化在84例患者的组织切片检测CCL20的表达水平，发现CCL20在肝癌组织中的表达明显强于癌旁组织，（P＜0.001）；同一患者中CCL20表达水平：癌栓＞癌＞癌旁（P＜0.001）。临床资料分析提示：CCL20表达水平是影响患者总体生存时间的独立危险因素（相对危险度为1.310）。本研究本课题通过对肝癌细胞系Huh7、HepG2及PVTT转染siRNA-CCL20干扰细胞CCL20的表达。以siRNA-CCL20组为干扰组，siRNA-N组为对照组。与对照组相比，三个细胞系中干扰组AQP5基因的mRNA及蛋白表达水平均明显下降，且同时伴有MMP2、MMP9、ERK1/2的表达水平下降。通过MTT细胞增殖实验、细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验比较两组细胞的增殖及侵袭能力发现，干扰CCL20的基因表达，可使上述三个细胞系细胞的增殖及侵袭能力明显下降。第三部分：NDRG2在原发性肝细胞癌伴胆管癌栓中的表达意义及功能NDRG2是NDRG（N-Myc downstream-regulated gene）家族中的一员，在一些神经系统退行性疾病中高表达，并已成为多种癌症中的候选抑癌基因。目前已知NDRG2表达与肝癌、胰腺癌、脑胶质瘤、前列腺癌，结直肠癌等多种常见恶性肿瘤关系密切，在这些肿瘤组织中表达下调，且其表达水平常常与患者肿瘤的恶性程度呈反比，与患者的预后呈正比。本研究在5例患者新鲜标本行Real-time PCR检测NDRG2mRNA水平，发现癌栓组织中明显弱于癌组织（P=0.002），且在有相应癌旁组织的3例标本中检测结果提示，同一患者中NDRG2mRNA表达水平：癌旁＞癌＞癌栓（P=0.014）。本课题用含有NDRG2序列的过表达质粒载体及空载体分别转染细胞系Huh7、HepG2及PVTT，过表达质粒组为过表达组，空载体组为对照组。与对照组相比，三个细胞系中过表达组NDRG2基因mRNA及蛋白水平均明显升高。在过表达组中，除在Huh7细胞中MMP2蛋白表达水平略高于对照组，但差异不明显外，各细胞系中均伴有MMP9、ERK1/2的蛋白表达水平下降，且MMP2在HepG2及PVTT细胞中均低于对照组。通过MTT细胞增殖实验、细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验比较两组细胞的增殖及侵袭能力发现，过表达NDRG2，可使上述三个细胞系细胞的增殖及侵袭能力明显下降。综上所述，通过本研究发现，AQP5、CCL20在肝癌伴胆管癌栓中明显高表达，且其表达量越高，肿瘤细胞的增殖及侵袭能力越强，患者预后越差；NDRG2在肝癌伴胆管癌栓中明显低表达，且其表达量越高，肿瘤细胞的增殖及侵袭能力越弱，患者预后越好。上述结果为今后原发性肝细胞癌伴胆管癌栓的预后判断及基因治疗提供了一定的参考。