一、目的与意义黑色素瘤是全世界皮肤肿瘤相关性死亡的主要原因(80%)。它是一种恶性程度较高,临床预后较差的恶性肿瘤。IV期黑色素瘤患者的中位生存时间少于1年,而5年生存期少于10%。黑色素瘤的发病率在世界范围内逐年增加,它的致死率的增长速度高于其他任何形式的恶性肿瘤。传统的晚期转移性恶性黑色素瘤的治疗包括:化疗(达卡巴嗪、替莫唑胺)、生物治疗(干扰素α-2b)及药物靶向治疗(vemurafenib和ipilimumab)等。由于这些治疗的肿瘤反应率低,肿瘤耐药的产生及严重的毒副作用而限制了它们的应用。因此,对于黑色素瘤的治疗仍然需要寻找新的治疗策略,新的靶点及新的治疗药物。人参是一个古老的中草药,它具有滋补、强心、抗炎、抗肿瘤和免疫刺激的作用。20(R)-人参皂苷Rg3是从人参中提取的单体成分,具有广泛的药理学活性和治疗作用。报道显示Rg3在结肠癌、胃癌、乳腺癌及肝癌中具有抑制肿瘤生长的作用;Rg3在前列腺癌和结肠癌中具有增加多西他赛和顺铂化疗敏感性的作用;Rg3在肝癌细胞中具有抗肿瘤血管形成和诱导凋亡的作用。目前,参一胶囊(其主要成分为Rg3)已经在中国被批准为治疗临床晚期非小细胞肺癌的辅助药物。蛋白质转录后的修饰与肿瘤发生发展密切相关,其中乙酰化和糖基化也成为抗恶性黑色素瘤的研究热点。然而Rg3抗黑色素瘤的作用机制是否与调控蛋白质的乙酰化和糖基化目前还不清楚。乙酰化和去乙酰化是调控基因表达的表观遗传学过程。异常的去乙酰化酶(HDACs)的表达与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。例如,HDAC6在人类乳腺癌和前列腺癌中过表达,HDAC2在宫颈癌和胃癌中过表达,HDAC8在儿童神经母细胞瘤中过表达。HDAC3的过表达也在许多恶性肿瘤中被报导,如肺癌、结肠癌、胃癌和前列腺癌。有研究认为HDAC3的表达与p53的乙酰化与肿瘤的生长有关。然而Rg3抗恶性黑色素瘤生长的机制是否与调节HDAC3和p53乙酰化的表达需要进一步探索。蛋白的糖基化在肿瘤病理生理过程中发挥重要的作用,包括肿瘤增殖、侵袭、血源性转移和血管形成。岩藻糖基化是蛋白糖基化的一种重要形式。岩藻糖基转移酶(FUTs)是催化合成岩藻糖的关键酶。其中FUT4是FUTs家族的成员之一,是催化合成α1,3-岩藻糖Le Y的关键酶。文献报道显示FUT4在很多肿瘤中过表达,例如在结肠癌、胃癌和肺癌中。过表达FUT4能够促进细胞的增殖、转移和抗凋亡。然而Rg3在恶性黑色素瘤生长诱导凋亡中的作用与潜在的调节FUT4表达与EGFR/MAPK和NF-κB信号通路目前仍不清楚。本研究通过Rg3对HDAC3和FUT4表达调控的研究,分析Rg3在黑色素瘤中抑制肿瘤生长诱导凋亡及其调控的相关信号通路,进一步探讨Rg3介导的抗黑色素瘤作用的分子机制,以期为临床治疗黑色素瘤提供科学依据。二、实验方法1、收集2003至2010年在大连医科大学附属第一医院病理科存档的石蜡组织标本且临床资料完整的恶性黑色素瘤患者32例。采用免疫组化法测定所有病理标本中HDAC3的表达情况,并对所有病例进行随访。分析HDAC3与患者临床病理特征和预后的相关性。应用SPSS16.0统计软件进行数据分析,以P<0.05为显著性标准。表达的组间差异比较采用χ2检验;2、利用CCK-8、MTT法及细胞克隆形成实验分析黑色素瘤细胞的增殖能力;3、利用脂质体瞬时转染技术将HDAC3 si RNA、FUT4 si RNA转染至人黑色素瘤细胞中,下调HDAC3和FUT4的表达;4、采用Real-time PCR的方法检测HDAC3、PCNA、FUT4和p65基因的表达;5、采用Western blot的方法检测HDAC3、FUT4、Le Y、Caspase-3、-8、-9、Bcl-2、Bax、Survivn、NF-κB和EGFR/MAPK信号通路等相关蛋白的表达;6、利用免疫組化和免疫荧光检测HDAC3、FUT4、PCNA和p65的表达;7、采用流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡;8、采用凝胶电泳迁移率(EMSA)方法检测NF-κB与DNA的结合情况;9、使用荧光素酶报告基因检测p53和NF-κB的活性情况;10、使用染色质免疫共沉淀(Ch IP)方法检测NF-κB与FUT4启动子区的结合情况。三、结果(一)人参皂苷Rg3抑制黑色素瘤的增殖与下调HDAC3,增加p53乙酰化的相关性研究1、HDAC3过表达与淋巴结转移及肿瘤分期有关;2、Rg3抑制黑色素瘤的生长;3、Rg3降低HDAC3的表达;4、下调HDAC3表达抑制细胞的增殖;5、Rg3和下调HDAC3的表达增加p53的乙酰化和转录活性;6、Rg3下调HDAC3改变细胞周期相关蛋白的表达;7、Rg3在体内抑制裸鼠肿瘤的生长。(二)人参皂苷Rg3抑制黑色素瘤增殖与下调FUT4/Le Y介导的EGFR/MAPK通路的失活的相关性研究1、Rg3抑制A375黑色素瘤细胞的生长;2、Rg3降低FUT4和Le Y的表达;3、下调FUT4的表达抑制A375细胞的增殖和减少Le Y的表达;4、下调FUT4的表达减少EGFR/MAPK通路的磷酸化;5、Rg3在体内抑制裸鼠肿瘤的生长。(三)人参皂苷Rg3诱导黑色素瘤凋亡与抑制FUT4表达通过靶向调节NF-κB/p65信号通路机制的研究1、Rg3抑制人黑色素瘤细胞的增殖;2、Rg3诱导黑色素瘤细胞的凋亡;3、Rg3抑制NF-κB信号通路的活性;4、Rg3下调FUT4的表达抑制NF-κB连接到FUT4启动子区;5、Rg3诱导凋亡通过抑制NF-κB信号通路及FUT4的下调;6、Rg3抑制黑色素瘤裸鼠肿瘤生长诱导凋亡。四、结论(一)人参皂苷Rg3抑制黑色素瘤的增殖与下调HDAC3,增加p53乙酰化的相关性研究1、Rg3具有抑制黑色素瘤裸鼠动物模型和黑色素瘤细胞生长的作用;2、Rg3下调HDAC3表达具有剂量和时间的依赖性;3、使用si RNA或HDAC3潜在的抑制剂(MS-275),下调HDAC3表达抑制黑色素瘤细胞的增殖;4、Rg3抑制黑色素瘤增殖通过抑制HDAC3的表达增加p53的乙酰化和转录活性。(二)人参皂苷Rg3抑制黑色素瘤增殖与下调FUT4/Le Y介导的EGFR/MAPK通路失活的相关性研究1、Rg3抑制黑色素瘤的生长与下调FUT4/Le Y有关;2、岩藻糖基转移酶FUT4与调控的糖抗原Le Y表达有关;3、Rg3抑制黑色素瘤增殖通过抑制FUT4/Le Y表达及其下游的EGFR/MAPK信号通路。(三)人参皂苷Rg3诱导黑色素瘤凋亡与抑制FUT4表达通过靶向调节NF-κB/p65信号通路机制的研究1、Rg3具有抑制黑色素瘤裸鼠动物模型和黑色素瘤细胞生长,诱导凋亡的作用;2、Rg3诱导细胞凋亡通过下调NF-κB信号通路蛋白的表达及NF-κB DNA连接/转录活性;3、NF-κB直接调控FUT4的启动子区,影响FUT4的表达;4、Rg3诱导凋亡通过抑制NF-κB信号通路介导的下调FUT4的表达。