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肝脏缺血再灌注损伤(Liver ischemia reperfusion injury,LIRI)是原发性肝移植术和肝切除术后肝功能损伤、衰竭的主要原因之一。自噬(Autophagy)是与细胞死亡和存活相关的过程,它通过降解细胞内化合物,来维持胞内能量的相对稳定,清除受损的细胞器和蛋白质聚集物。重度缺血会导致自噬过度增强,过度自噬却会破坏细胞内正常的蛋白质和细胞器,从而导致细胞死亡。现今,脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)在各种疾病中具有良好的治疗潜力,因而被认为可作为一种新型药物用于再生医学。然而,有一假设提出,ADSCs的治疗作用可能主要来源于其旁分泌作用。许多研究也证明,脂肪间充质干细胞条件培养基(Adipose-derived mesenchymal stem cells-conditioned medium,ADSCCM)中含有许多细胞因子与趋化因子。已有研究发现,ADSCs对肝缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)合并肝切除损伤引起的肝细胞过度自噬损伤具有良好的治疗作用。在此,我们提出一个假设,ADSC-CM对肝IRI合并肝切除引起的肝细胞过度自噬损伤具有治疗作用。ADSCs可能通过其旁分泌作用对肝IRI合并肝切除肝细胞过度自噬损伤进行治疗,从而起到保护肝脏,促进肝组织修复过程。除此之外,进一步深入探讨了ADSC-CM对肝IRI合并肝切除肝细胞过度自噬损伤的治疗机制。本实验选取了24头健康小型猪,随机分为四组(n=6),分别为模型组(IRI组)、DMEM对照组(DMEM组)、ADSCs治疗组(ADSCs组)和ADSC-CM治疗组(CM组)。各组均采用腹腔镜手术建立相同的模型(右半肝缺血60 min合并左半肝切除),并均于术后即刻肝实质注射相同剂量的相应干预物。IRI组注射生理盐水,DMEM组注射DMEM,ADSCs组注射ADSCs重悬液,CM组注射ADSC-CM浓缩液。各组分别于术前,术后1 d,术后3 d、术后7 d应用腹腔镜手术采取肝脏组织样本,进行电镜超微结构检测,并采用RT-q PCR、Western blot、免疫组化等方法检测肝组织样本中的自噬参数变化情况,具体检查指标包括:自噬相关因子Beclin1、LC3II、p62、ATG5、ATG12、自噬通路PI3K-AKT-m TOR相关因子PI3K、AKT、m TOR。本实验顺利完成模型建立,且术后恢复良好。电镜结果显示:术后1 d,各组均出现了明显的自噬结构。其中,IRI组与DMEM组肝细胞整体结构破坏严重,线粒体和内质网发生肿胀,甚至出现线粒体嵴消失,细胞核皱缩变形等现象;ADSCs组和CM组肝细胞结构较为清晰,线粒体与内质网轻微肿胀,胞核结构基本正常。RT-q PCR结果显示:术后1 d、3 d、7 d,DMEM组与IRI组相比,自噬相关基因(Beclin1、ATG5、ATG12、p62),自噬通路相关基因(PI3K、AKT、m TOR)表达水平无显著性差异(p>0.05)。术后1 d、3 d,ADSCs组与IRI组相比,Beclin1、ATG5、ATG12 m RNA表达水平显著性降低(p<0.05),p62 m RNA表达水平显著性升高(p<0.05),PI3K、AKT、m TOR m RNA表达水平极显著性升高(p<0.01);CM组与DMEM组相比,Beclin1、ATG5、ATG12 m RNA表达水平显著性降低(p<0.05),p62m RNA表达水平显著性升高(p<0.05),PI3K、AKT、m TOR m RNA表达水平极显著性升高(p<0.01)。术后7 d,各组数据无显著性差异(p>0.05)。术后1 d、3 d、7 d,ADSCs组与CM组之间的自噬相关基因Beclin1、ATG5、ATG12、p62表达量均无显著性差异(p>0.05)。WesternBlot结果显示:术后1 d、3 d、7 d,DMEM组与IRI组之间各自噬相关蛋白(Beclin1、LC3II、p62),自噬通路相关蛋白比值(p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR)数据差异不显著(p>0.05)。术后1 d、3 d,ADSCs组与IRI组相比,Beclin1、LC3 II蛋白水平极显著性降低(p<0.01),p62蛋白水平极显著性升高(p<0.01),p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR比值极显著性升高(p<0.01);CM组与DMEM组相比,Beclin1、LC3 II蛋白水平极显著性降低(p<0.01),p62蛋白水平极显著性升高(p<0.01),p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR比值极显著性升高(p<0.01)。术后7 d,各组之间无显著性差异(p>0.05)。术后1 d、3 d、7 d,自噬相关蛋白Beclin1、LC3II、p62表达量无显著性差异(p>0.05)。免疫组化结果显示,检测LC3 II蛋白结果与其WesternBlot结果相一致。综上所述:(1)ADSC-CM能显著改善肝IRI合并肝部分切除肝细胞过度自噬损伤,且可能是通过自噬相关通路PI3K-AKT-m TOR来抑制肝细胞过度自噬损伤。(2)ADSCs组与CM组在自噬方面数据显示无显著差异。因而,ADSCs可能通过旁分泌作用改善肝IRI合并肝部分切除肝细胞过度自噬损伤。