九香虫是一种具有温肾壮阳作用的中药材,常用于治疗肾虚阳痿等病症,即勃起功能障碍。勃起功能障碍是现在国际上备受关注的一种疾病,很多中老年男性深受其困扰,而不得治愈。临床上治疗勃起功能障碍主要通过西地那非类药物治疗,少量辅以睾酮补充疗法,而这些方法大多仅能起到短时间的治疗作用,并不能根治。2015版中国药典记载九香虫具有理气止痛,温中助阳的功效,用于畏寒胀痛,肝胃气痛,肾虚阳痿,腰膝酸痛。九香虫作为一种传统的壮阳类中药,但用于治疗勃起功能障碍的研究机制鲜有报道,对九香虫资源的开发与利用造成了阻碍。本实验研究通过正常小鼠、阳虚小鼠、阳虚大鼠、睾丸间质细胞模型等方法,在体内和体外层面联合研究九香虫抗疲劳温肾壮阳能力九香虫提取物抗疲劳能力,并探究九香虫温肾壮阳的物质基础及其作用机制。目的:确证九香虫温肾壮阳作用,定位九香虫主要药效活性部位,探究九香虫相似品的药理作用,分析九香虫可能的作用机制。方法:(1)通过抗疲劳实验测试正常小鼠的血清乳酸含量,血尿素氮含量,力竭游泳时间;采用氢化可的松造肾阳虚模型,观察小鼠交配能力,血清中睾酮含量,脏器系数,睾丸组织HE染色。(2)通过石油醚部位,水部位,醇沉部位将九香虫提取物分段,灌胃正常小鼠,观察小鼠交配能力,并检测睾酮含量。(3)收集市场上常见的九香虫相似品,小皱蝽,黑兜虫,无刺蝽,灌胃氢化可的松造模的肾阳虚小鼠,观察交配能力,并检测血清睾酮含量。(4)分离和纯化大鼠原代睾丸间质细胞,运用ELISA酶联免疫法检测九香虫不同提取部位和九香虫不同相似品对睾丸间质细胞分泌睾酮含量的影响,实时荧光定量PCR检测细胞中StAR、3β-HSD、CYP11a1睾酮合成相关基因的表达量。(5)通过皮下注射氢化可的松造模肾阳虚大鼠,观察大鼠交配能力,检测脏器系数,血清睾酮、黄体生成素、促卵泡生长素含量,大鼠睾丸HE染色组织形态。蛋白质组学分析其主要涉及到的生物学过程及信号通路,蛋白免疫印迹实验分析StAR、3β-HSD、CYP17a1蛋白的表达。结果:(1)九香虫提取物的抗疲劳实验结果表明,九香虫7g/kg剂量组能降低正常小鼠血清中乳酸、尿素氮的含量,增强力竭游泳时间,提高抗疲劳能力;对氢化可的松所致肾阳虚小鼠的交配能力实验发现,九香虫提取物能改善小鼠生理状态,提高阳虚小鼠交配能力,恢复阳虚小鼠性腺脏器系数和睾酮水平,并对损伤睾丸组织具有保护作用。(2)九香虫不同提取部位对正常小鼠的交配能力实验发现,九香虫提取物醇沉部位具有明显的壮阳作用,能缩短小鼠捕捉潜伏期,交配潜伏期,提高小鼠捕捉次数,交配次数,从而提高交配能力,同时能提高血清中睾酮的含量。(3)检测九香虫相似品,小皱蝽、黑兜虫、无刺蝽对肾阳虚小鼠的交配能力的影响发现,小皱蝽、黑兜虫在一定程度上能提高小鼠交配能力,并能恢复睾酮水平,而无刺蝽组未见显著性差异。(4)九香虫及相似品对LCs细胞睾酮分泌的影响发现,九香虫、黑兜虫、小皱蝽均具有促进睾酮分泌的作用,而无刺蝽活性不显著。九香虫水提取物的促进睾酮分泌作用明显强于醇提取物,水提醇沉部分活性更显著,且醇沉浓度越低活性越好。通过分析九香虫醇沉部位对cAMP/PKA信号通路中相关mRNA表达的影响,发现能九香虫醇沉部位可能通过促进StAR等基因的表达而促进睾酮合成,从而促进睾酮的分泌。(5)九香虫提取物对肾阳虚大鼠交配能力的影响可以看出,九香虫提取物可以恢复氢化可的松引起的性腺脏器重量减轻,修复睾丸组织病理损伤,能缩短大鼠捕捉潜伏期、交配潜伏期,增加捕捉次数、交配次数,提高捕捉率、交配率来达到提高交配能力的作用,并且以九香虫中剂量效果最佳,具有极其显著性差异。同时,九香虫可以通过调节下丘脑-垂体-性腺轴激素途径来调节睾酮的分泌。蛋白组学检测发现九香虫壮阳作用的可能信号通路包括类固醇、脂质代谢,精子生成通路,蛋白质转运等途径,同时也涉及凝血机制等。蛋白免疫印迹对蛋白组学的结果进行了验证,通过上调StAR,3β-HSD,CYP17a1等蛋白的表达,调节cAMP/PKA信号通路来调节睾酮分泌。结论:九香虫及相似品(小皱蝽、黑兜虫)具有温肾壮阳作用,而无刺蝽壮阳效果不显著;九香虫提取物抗疲劳和壮阳作用的药效物质基础为其中高极性成分,可能为蛋白和多糖类成分;其温肾壮阳作用机制为通过cAMP-PKA信号通路和下丘脑-垂体-性腺轴途径来调节睾酮分泌。