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背景:随着糖尿病(Diabetes mellitus,DM)发病率的逐年升高,WTO预计到2025年糖尿病患者的人数将达到3.0亿左右,而在男性糖尿病患者中,勃起功能障碍(Erectile dysfunction,ED)是其常见的并发症之一,糖尿病性ED整体发病率是普通人的3～5倍,并且发病时间比普通人早10年左右,病程更加复杂,治疗也更加困难。而糖尿病性ED的发病机制尚未明确,在勃起的组织中,阴茎海绵体平滑肌是其主要的结构,近些年来研究者逐渐将研究糖尿病性ED的发病机制的目光集中到阴茎海绵体平滑肌细胞(Corpus Cavernosum Smooth Muscle Cells,CCSMCs)上来。糖尿病性ED机体中CCSMCs功能、形态、数量等方面发生的改变已得到证实。但发生机制尚未明确。有研究证实细胞自噬(Autophagy)、内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)和细胞凋亡(Apoptosis)是糖尿病发生和发展的重要途径。而雷帕霉素可促进自噬,抑制内质网应激和凋亡,那么在糖尿病性勃起功能障碍CCSMCCs中是否也存在着自噬、内质网应激和凋亡,雷帕霉素对自噬、内质网应激和凋亡在糖尿病性勃起功能障碍CCSMCCs中又有何种作用?目前研究尚少,值得进一步研究,以期为糖尿病性ED发病机制和治疗措施的研究提供思路。目的:探索雷帕霉素对葡萄糖诱导SD大鼠CCSMCs自噬、内质网应激与凋亡的影响。方法:(1)检测不同浓度葡萄糖干预CCSMCs后自噬、内质网应激与凋亡相关指标的变化:取SD大鼠阴茎海绵体组织分离纯化培养CCSMCs,经碱性调宁蛋白(calponin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光鉴定确定后,分别用含浓度为5.6mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L葡萄糖的完全培养基体外培养CCSMCs 48h。MTT检测各组细胞活力;mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染检测各组自噬流;Western blot检测自噬相关指标自噬相关基因5(autophagy-related gene 5,ATG5)、Beclin1、P62、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)及内质网应激相关指标葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的蛋白表达变化;PCR检测自噬相关指标ATG5、Beclin1、P62、LC3的mRNA表达变化;流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。(2)检测雷帕霉素对高浓度葡萄糖诱导SD大鼠CCSMCs自噬、内质网应激与凋亡的影响:分别含浓度为5.6mmol/L、40mmol/L葡萄糖的完全培养基培养培养48h以及先用600nmol/L的雷帕霉素(Rapamycin,Rap)预处理2h后再用40mmol/L葡萄糖的完全培养基培养培养48h。Western blot和PCR检测自噬相关指标P62、LC3、Beclin1及内质网应激相关指标GRP78、CHOP的蛋白和mRNA表达变化;流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。结果:(1)细胞经传代纯化后经免疫荧光法鉴定,calponin和α-SMA均呈强阳性CCSMCs原代培养成功;MTT检测发现相对于5.6mmol/L葡萄糖组,10mmol/L葡萄糖组CCSMCs活力无明显减弱,但随着葡萄糖浓度升高,CCSMCs活力下降明显(P<0.01)。mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染、Western blot以及PCR检测均提示不同浓度葡萄糖处理后均发生了自噬现象,随着葡萄糖浓度升高,在10mmol/L葡萄糖组自噬现象最强(P<0.05),之后随着葡萄糖浓度升高自噬现象逐渐减弱(P<0.05);Western blot检测提示相对于5.6mmol/L葡萄糖组,10mmol/L葡萄糖的内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP无显著变化,但随着葡萄糖浓度增高,GRP78和CHOP的表达量逐渐增多(P<0.01)。流式细胞术检测发现相对于5.6mmol/L葡萄糖组,10mmol/L葡萄糖组细胞凋亡率无统计学差异(P=0.302),但随着葡萄糖浓度升高,细胞凋亡率逐渐升高(P<0.01)。(2)给予雷帕霉素预处理后,Western blot检测均提示LC3、Beclin1的蛋白表达量增多(P<0.05),而P62的蛋白表达量降低(P<0.05),表明自噬增强,内质网应激相关指标GRP78、CHOP的蛋白和mRNA表达水平在雷帕霉素预处理后均降低(P<0.05),流式细胞术检测发现用雷帕霉素预处理后细胞凋亡率降低(P<0.01)。结论:(1)当不同浓度葡萄糖体外培养CCSMCs,葡萄浓度在一定范围内时可能通过促进自噬,对CCSMCs起到保护作用,维持细胞活力和功能。当葡萄糖浓度超过一定浓度后,可能超出了CCSMCs承受的范围,出现自噬降低,并激活内质网应激,促进细胞凋亡,从而损害细胞活力和功能。(2)高浓度葡萄糖作用于CCSMCs,雷帕霉素可能通过增强自噬,抑制内质网应激和凋亡水平,从而对CCSMCs起到保护作用。