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研究背景及目的:糖尿病已经成为全球重大公共卫生问题,全球约4.5亿人患有糖尿病,在我国18岁以上人群中发病率高达10.8%,其中90%以上为2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）。T2DM发病率高,并发症多,远期危害大,治疗经济负担重,是亟需深入研究的重大慢性疾病。外科手术治疗是治疗肥胖合并T2DM的有效手段,其确切的疗效让人看到根治T2DM的希望。Roux-en-Y胃旁路术（Roux-en-Y gastric bypass,RYGB）是代谢手术的主流标准术式之一,其抗T2DM作用较其他术式更持久且不易复发反弹。但由于RYGB术创伤较大、术后腹泻、严重营养不良等并发症较常见、改变人体正常肠道解剖不利于术后胃肠疾病管理等不利因素,目前还难以在体重正常的T2DM患者中合理开展。但RYGB术后即时的缓解T2DM效果证实其存在独立于限制能量摄入所导致体重下降之外的抗T2DM机制。明确这些机制将有助于RYGB治疗T2DM效果的药物转化。但RYGB缓解T2DM的机制十分复杂,目前尚未完全明确。脂肪组织是发生胰岛素抵抗的主要部位,在T2DM发生发展中具有重要作用。脂肪组织分为储能的白色脂肪组织（White adipose tissue,WAT）及高效耗能的棕色脂肪组织（Brown adipose tissue,BAT）,两者之间在一定条件下能发生表型的转化。其中,WAT向BAT的转化称为脂肪组织的棕色化。近年来发现,脂肪组织的棕色化能有效增加葡萄糖的摄取与消耗,提高机体胰岛素敏感性,有望成为治疗肥胖及T2DM的新靶点。有研究发现RYGB具有促进脂肪组织棕色化的作用,脂肪组织棕色化有可能是RYGB缓解T2DM的重要机制之一,但其具体机制尚未完全明确。而脂肪组织棕色化与脂肪组织的炎症状态有关,RYGB术后肠道菌群的改变能降低肠源性细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）的入血,降低LPS诱导炎症水平。但RYGB术后是否能通过下调LPS介导脂肪组织棕色化尚未完全阐明。综上所述,本研究拟通过肥胖T2DM大鼠模型明确RYGB术后LPS改变及其诱导炎症水平与脂肪组织棕色化之间的关系,进一步通过细胞实验探讨其具体机制,为RYGB缓解T2DM的机制及脂肪组织棕色化治疗肥胖及T2DM提供新的理论依据。第一部分RYGB对肥胖T2DM大鼠炎症水平及脂肪组织棕色化的影响目的:探讨RYGB对肥胖T2DM大鼠血清LPS、炎症因子水平、脂肪组织巨噬细胞浸润及棕色化的影响。方法:根据实验目的对正常SD大鼠及链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）诱导肥胖T2DM大鼠分为正常对照组（Control,CON,n=6）、RYGB手术组（RYGB surgery,n=6）、假手术组（Sham surgery,Sham,n=6）及体重匹配组（Weight matched,WM,n=6）。检测术后4周各组间静脉血空腹血糖,血清胰岛素、LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10浓度差异,免疫组化染色评估各组脂肪组织巨噬细胞浸润情况,并通过实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative PCR,q PCR）及蛋白免疫印迹（Western blot,WB）测定各组脂肪组织中棕色化标志分子解偶联蛋白1（Uncoupling protein 1,UCP1）的表达差异。结果:RYGB组术后空腹血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数（Homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）、LPS、及TNF-α水平较Sham组（P<0.01）及WM组（P<0.05）明显降低。RYGB组IL-10水平显著高于Sham组（P=0.042）及WM组（P=0.034）。RYGB组BAT及WAT中CD68+巨噬细胞浸润数目较Sham组及WM组显著减少（BAT:P<0.01;WAT:P<0.05）,其中i NOS+M1型巨噬细胞数目明显减少（BAT:P<0.01;WAT:P<0.01）,而CD206+M2型巨噬细胞数目明显增多（BAT:P<0.05;WAT:P<0.01）。RYGB组较Sham组及WM组显著上调BAT及WAT中UCP1 m RNA表达（BAT:P<0.01;WAT:P<0.01）及蛋白表达（BAT:P<0.05;WAT:P<0.01）。UCP1表达与血清LPS水平显著负相关（m RNA:BAT,r=-0.561,P<0.001、WAT,r=-0.761,P=0.004;蛋白:BAT,r=-0.709,P<0.001、WAT,r=-0.614,P=0.001）。结论:RYGB能缓解肥胖T2DM大鼠炎症水平,下调血清LPS及TNF-α浓度,上调血清IL-10浓度,并能抑制脂肪组织以M1型巨噬细胞浸润为主的炎症背景,促进脂肪组织棕色化。脂肪组织棕色化水平与血清LPS浓度负相关。第二部分LPS在RYGB促进肥胖T2DM大鼠脂肪组织棕色化中的作用目的:验证LPS下降在RYGB术后缓解炎症水平及促进脂肪组织棕色化中的作用。方法:对正常SD大鼠及RYGB术后STZ肥胖T2DM大鼠分别给予腹腔连续注射LPS（150μg/kg/天×8周）及等量生理盐水,共分为四组:正常大鼠+生理盐水对照组（Normal Control,NC,n=5）、正常大鼠+LPS干预组（Normal+LPS,NL,n=5）、手术大鼠+生理盐水对照组（Surgery Control,SC,n=5）及手术大鼠+LPS组（Surgery+LPS,SL,n=5）。检测8周后各组空腹血糖,血清胰岛素、炎症因子浓度,脂肪组织巨噬细胞浸润情况及脂肪组织中UCP1的表达情况。结果:NL组给予LPS干预8周内,除第7周空腹血糖低于NC组外（P=0.048）,其余时间点间均无显著差异。SL组给予LPS干预后空腹血糖逐渐升高,LPS注射第5、7、8周空腹血糖显著高于SC组（5w:P=0.025;7w:P=0.017;8w:P=0.044）。第8周NL组HOMA-IR、血清胰岛素、IL-1β及TNF-α显著高于NC组（P<0.05）;SL组HOMA-IR、血清胰岛素、IL-1β及TNF-α明显高于SC组（P<0.05）;而SL组IL-10显著低于SC组（P=0.019）。LPS显著增加NL组及SL组BAT及WAT中CD68+巨噬细胞数目（NL vs.NC,P<0.01;SL vs.SC,P<0.01）,其中i NOS+M1型巨噬细胞数目明显增多（NL vs.NC,P<0.05;SL vs.SC,P<0.01）,SL组中CD206+M2型巨噬细胞数目明显减少（BAT:SL vs.SC,P=0.019;WAT:SL vs.SC,P=0.015）。LPS显著下调NL组及SL组BAT及WAT中UCP1 m RNA表达（NL vs.NC,P<0.05;SL vs.SC,P<0.05）及蛋白表达（NL vs.NC,P<0.05;SL vs.SC,P<0.01）。结论:LPS能升高RYGB术后肥胖T2DM大鼠的炎症水平,促进脂肪组织巨噬细胞炎性浸润并抑制棕色化,明显抑制RYGB对炎症及脂肪组织棕色化的作用。LPS可能是介导RYGB缓解炎症并促进脂肪组织棕色化的关键机制分子。第三部分LPS及M1、M2型极化巨噬细胞对脂肪细胞棕色化的作用及机制目的:探讨LPS及M1、M2型极化巨噬细胞对脂肪细胞棕色化的作用及机制。方法:分离原代大鼠皮下脂肪血管基质细胞,成脂诱导成脂肪细胞。通过LPS刺激由去甲肾上腺素及三碘甲状腺氨酸诱导的棕色样脂肪细胞。q-PCR及WB检测LPS刺激组（LPS,n=4）及PBS对照组（CON,n=4）的UCP1及Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）炎症相关分子表达差异。分离培养大鼠骨髓巨噬细胞,并诱导成M1、M2型极化巨噬细胞,分别与棕色化诱导原代脂肪细胞共培养后,检测单独脂肪细胞培养对照组（CON,n=4）,M1型巨噬细胞共培养组（M1,n=4）及M2型巨噬细胞共培养组（M2,n=4）的UCP1及血管细胞粘附分子1（Vascular Cell Adhesion Molecule1,VCAM1）表达情况。结果:LPS组TLR2、TLR4及TNF-αm RNA表达较CON组显著上调（TLR2:12.19±2.43倍,P=0.019;TLR4:8.07±1.72倍,P=0.026;TNF-α:31.78±6.05倍,P=0.015）,但对UCP1表达无影响（m RNA:P=0.702;蛋白:P=0.366）。巨噬细胞与脂肪细胞非接触共培养模式下CON组、M1组及M2组在UCP1 m RNA及蛋白表达水平上未见统计学差异（m RNA:P=0.222;蛋白:P=0.741）。巨噬细胞与脂肪细胞直接接触共培养模式下M1组UCP1 m RNA表达显著下调为CON组0.18±0.01倍（P<0.001）,且较M2组显著降低（P=0.020）。M1组UCP1蛋白表达下调为CON组0.50±0.06倍（P=0.004）,且M2组UCP1蛋白表达显著高于M1组（P=0.006）。接触共培养模式下M1组VCAM1 m RNA表达上调为CON组的8.83±0.94倍（P=0.004）,并显著高于M2组（P=0.007）。M1型巨噬细胞共培养下脂肪细胞VCAM1 m RNA表达与UCP1 m RNA表达显著负相关（r=-0.909,P=0.002）。结论:LPS能显著激活脂肪细胞TLR-TNF-α炎症信号通路,但对脂肪细胞棕色化未见明显作用。LPS诱导的M1型巨噬细胞可通过直接接触方式抑制脂肪细胞棕色化,而VCAM1的上调可能是介导M1巨噬细胞抑制脂肪细胞棕色化的重要机制之一。