[研究背景与目的] 恶性肿瘤是一种涉及若干细胞信号通路异常的复杂疾病。而且，癌细胞不断分化，产生对治疗(特别是毒副作用较大的放疗和化疗)的抵抗性。目前，应用能够区分正常和转化状态并最终诱导肿瘤细胞凋亡的特异性基因进行肿瘤治疗的策略正越来越受到重视。黑素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7，mda-7)就是根据“分化治疗”原理于二十世纪九十年代初筛选鉴定出来的一个特异性靶肿瘤细胞基因。出乎意料的是，后来发现mda-7与细胞因子IL-10家族基因具有同源性和亲缘关系，属于IL-10家族，因此，2001年被重新命名为IL-24。 人类IL-24由具有免疫活性的细胞分泌，能刺激促炎症因子产生，参与免疫活化。除此之外，对于IL-24作为细胞因子的确切功能了解甚少。而IL-24明显不同于其他细胞因子的特性，尤其是它具有的抗肿瘤基因治疗潜能，正引起人们越来越多的兴趣。大量的资料表明，复制缺陷腺病毒介导mda-7／IL-24(Ad. mda-7)基因表达可引起广泛的肿瘤细胞生长抑制并诱导凋亡，而对正常细胞无明显影响。目前在美国，Ad. mda-7已进入Ⅱ期临床试验。 尽管如此，IL-24选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机理并不清楚。由于现有的抗肿瘤研究资料均不是建立在将MDA-7作为一个细胞因子的基础上，因此在MDA-7新近被确认为分泌性细胞因子后，许多问题亟待研究或需要重新认识。本研究试图解答两个尚待解答的基本科学问题：其一，异位表达MDA-7／IL-24诱导肿瘤细胞凋亡的作用是否由分泌性蛋白通过细胞膜受体发挥作用?其二，肝癌是我国的特色癌。对于这样一个严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤迄今尚未见有关MDA-7／IL-24治疗的报道，尽管相关研究已涉及10多个类型恶性肿瘤。因此，回答MDA-7／IL-24对肝癌是否亦具有凋亡诱导作用，对于我们来说，无疑具有必要性。 本研究应用基因重组技术获得由Igk前导肽序列、IL-24 cDNA和myc-tag等基因片段组成的融合基因pIgk7m，通过载体pcDNA3.1转染真核细胞，表达分泌性第二军医大学中文摘要硕士学位论文rhIL一24蛋白，以研究其对肝癌细胞生长的影响，进一步验证其肿瘤生长抑制作用，同时研究其特异性诱导肝癌细胞凋亡作用是否通过细胞膜受体起作用，为rhIL一24用于临床靶向治疗肿瘤提供实验资料和依据。[研究方法] 1.以人体脾脏组织总RN人为模板，应用RT一PCR克隆IL一24 cDNA，并重组由Igk前导肤序列(蛋白分泌需要的信号肤)、IL一24 cDNA(不包括自身的前导肤序列)和myc一tag(便于检测的“标签”)组成的融合基因工gk7m，构建真核细胞表达载体PeDNA3.1一Igk7m。2.pcoN人3，一Igk?m转染人胚胎肾细胞株293，经G418筛选，Northernwe 5 t ern bz。t鉴定，挑选高表达:hIL一24的阳性克隆大量培养，收集培养液，浓缩分泌性rhIL一24蛋白。b lot和 富集、 3.体外培养肝癌细胞株BEL一7 4 02、Hep3B、Huh一7、PLC/PRF/5、SMMC一7721和正常肝细胞株wRL一68，给予粗提的rh工L一24蛋白，应用多种细胞死亡试验和其他实验手段检测培养细胞经rhl卜24处理后在细胞数量、细胞凋亡等方面的变化。根据获得的实验数据比较rhIL一24对正常肝细胞株和肝癌细胞株生长的不同影响，分析分泌性工L一24蛋白是否通过受体而发挥肝癌细胞凋亡诱导作用。 4.体外培养肝癌细胞株SMMC一7 7 21，给子粗提的rh工L一24蛋白处理一定时间，然后与未处理的S刚C一7721细胞同时接种至裸鼠皮下，观察比较两种SMMC一7721细胞在裸鼠活体内的成瘤大小，分析分泌性rh工L一24蛋白对活体内肝癌生长的影响。〔实验结果〕 1.从人体脾脏组织中克隆了工L一2 4 cDNA，经测序鉴定，核普酸序列与文献报道完全一致，无碱基突变。 2.成功地重组了由工gk前导肤序列、工L一24。DNA和myc一tag组成的融合基因Igk7m，经测序鉴定，各基因片段的核普酸序列与文献报道完全一致，符合设计要求。 3.Northern blot可检测到基因稳定转染的293细胞内表达工L一24 mRNA，westernblot在细胞内、外均检测到rh工L一24蛋白。 4.分泌性rhIL一24蛋白处理后，培养的BEL一7402、Hep3B、Huh一7、PLC/PRF/5、SMMC一7 7 21等肝癌细胞株均增殖减缓、生长抑制，而且随着rh工L一24浓度增加而明显。经同样处理的正常肝细胞株WRL一68并无明显变化。对不同处理时间点的各肝癌细胞和正常肝细胞的细胞数进行统计学多因素析因分析后显示，3种rh工L一2礴浓度处理均第二军医大学中文摘要硕士学位论文可显著抑制5种肝癌细胞的生长增殖(尸<0.01)，且生长抑制效应随rh1L一24蛋白浓度增加而增强(浓度主效应尸<0 .01)，但3种rhIL一24浓度均未能引起正常肝细胞明显的生长抑制(尸>0.05)，且各浓度间效应无明显差别(浓度效应尸>0.05)。 5.与正常肝细胞相比，各肝癌细胞株在rhIL一24蛋白处理后均出现了明显的凋亡征象.用相同浓度rML一24蛋白处理肝癌细胞后，PLC/PRF/5细胞的凋亡细胞百分率较高，为67.31%，而HeP3B细胞的凋亡细胞百分率教低，为34.47%。5种肝癌细胞的凋亡细胞百分率均较未用rhIL一24蛋白处理的凋亡率明显增加