[研究背景]酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是指长期大量饮酒所致的慢性肝病,初期通常表现为酒精性脂肪肝。如若得不到及时控制,酒精性脂肪肝会进一步发展成为酒精性肝炎、肝纤维化甚至是肝硬化。目前临床上尚无有效治疗ALD的药物。最新研究表明,在酒精性肝炎中还存在一种新型死亡方式——焦亡。细胞焦亡主要由gasdermin蛋白家族介导,通常表现为细胞肿胀、染色质凝聚、细胞膜破裂以及内含物释放。焦亡分为经典途径和非经典途径,经典途径由caspase-1介导,非经典途径由caspase-4/5/11介导。有研究证实,抑制肝细胞焦亡能够缓解酒精性肝炎,这为抗ALD药物的开发提供了新思路。研究发现,NLRP3炎症小体是caspase-1活化的一个必须因素,而NLRP3的活化又会受到ROS的影响。线粒体作为细胞内ROS的重要来源,受到线粒体融合蛋白和线粒体分裂蛋白的调控。线粒体融合蛋白Mfn2除了对于线粒体形态有调节作用,还能调控脂质代谢和ROS聚集。同时Mfn2受到转录调节因子PGC-1α的调控。因此,PGC-1α/Mfn2可能是调控细胞焦亡的关键因子。随着对传统中医药研究的深入,越来越多的天然活性成分被提取、开发,这就启发我们可以从天然产物中寻找到防治ALD的有效药物。本课题组长期以来一直专注于研究中药活性成分对慢性肝病的作用及其机制。千层纸素A(oroxylin A)是一种从黄芩或木蝴蝶中提取出来的黄酮类化合物,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效。在这之前,我们已经发现千层纸素A能够有效缓解肝纤维化、肝内血管生成,但是其对酒精性肝炎是否有改善作用以及其具体机制尚无定论。因此本论文将通过体内外实验探究千层纸素A在抗肝细胞焦亡中的作用及其机制。该研究结果可以为开发千层纸素A作为抗ALD的药物提供依据。[研究方法]1.细胞水平:选取人源肝细胞系LO2作为本论文体外研究对象。MTT检测细胞活力;western blot、免疫荧光染色法和real-time PCR检测LO2细胞内目的蛋白及基因的表达情况;油红O染色和尼罗红染色检测LO2细胞内脂滴含量;光学显微镜观察LO2细胞形态;电子透射显微镜观察LO2内的亚细胞结构;试剂盒检测 LO2 细胞中的 TG、TC、MDA、LDH、ATP、SOD 和 GSH/GSSH水平;JC-1染色检测LO2细胞中的线粒体膜电位;MitoSox红色荧光探针检测LO2细胞内线粒体过氧化物的含量;流式细胞仪检测LO2细胞中caspase-1/PI双阳性率。2.动物水平:使用Lieber-DeCarli酒精液体饲料加酒精灌胃构建小鼠酒精性肝炎模型,通过小鼠尾静脉注射慢病毒包裹的Mfn2 shRNA(每两周一次),并给予千层纸素A(40mg/kg)灌胃治疗(一天一次)。H&E染色检测小鼠肝脏组织学结构;油红O染色检测小鼠肝脏脂质沉积情况;生化试剂盒检测小鼠血清中炎症因子和肝损伤指标水平;免疫组织化学染色检测小鼠肝脏中炎症浸润水平和目标蛋白表达情况;western blot和real-time PCR检测LO2细胞内目的蛋白及基因的表达情况;流式细胞仪检测肝细胞caspase-1/PI双阳性率。[研究结果]首先,通过体内构建小鼠酒精性肝炎模型明确了千层纸素A能够逆转模型组小鼠肝脏病理组织结构和炎症浸润情况。同时,油红O染色显示千层纸素A能够缓解模型小鼠肝脏内的脂质沉积;血清学检测说明,千层纸素A明显缓解模型小鼠肝损伤指标。接下来,构建体外模型检测千层纸素A对LO2的保护作用。油红O染色、尼罗红染色和TG、TC检测说明千层纸素A减少肝细胞内乙醇诱导的脂质聚集;通过光镜下直接观察细胞形态发现千层纸素A能够恢复细胞正常形态。Western blot结果显示干层纸素A仅对caspse-1经典焦亡途径有抑制作用,而对于caspse-4/5非经典焦亡途径则没有影响。结果还显示,千层纸素A能够抑制下游炎症因子IL-1β、IL-18和焦亡执行蛋白GSDMD活化。同时,caspase-1/PI荧光双染结果进一步证实,千层纸素A确实能够抑制乙醇诱导的细胞焦亡。接着,使用caspase-1特异性抑制剂Z-YVAD-FMK进行验证,发现Z-YVAD-FMK和千层纸素A作用一致,能够协同削弱caspse-1通路相关蛋白的活化。Real-time PCR,western blot和免疫荧光结果显示,千层纸素A能够同时降低NLRP3、ASC的基因和蛋白水平。NLRP3寡聚化抑制剂MCC950能够协同千层纸素A削弱caspse-1通路相关蛋白的活化。下一步检测千层纸素A对线粒体的保护作用。MitoSOX染色说明千层纸素A减少线粒体过氧化物的堆积;JC-1染色结果说明千层纸素A恢复线粒体膜电位;透射电镜直接观察到千层纸素A恢复线粒体结构;生化指标说明,千层纸素A 增加 MDA 和 LDH 含量,降低 ATP、SOD 和 GSH/GSSH 水平;western blot 结果发现BSO削弱千层纸素A对caspse-1通路的抑制作用。接着,探究千层纸素A通过介导PGC-1α和Mfn2对线粒体功能的调控作用。Western blot结果说明,千层纸素A能够恢复乙醇下调的PGC-1α和Mfn2蛋白水平;western blot结果还说明PGC-1α siRNA和Mfn2 siRNA分别能够抵消千层纸素A对caspse-1经典焦亡通路的抑制作用;MitoSOX染色结果说明,PGC-1α siRNA和Mfn2 siRNA分别能够削弱千层纸素A对线粒体过氧化的清除作用。最后使用Mfn2 shRNA进行体内机制验证。免疫组化和western blot结果说明,Mfn2 shRNA能够抵消千层纸素A对caspse-1通路的抑制作用;血清学检测说明Mfn2 shRNA能够抵消千层纸素A对肝损伤指标和炎症因子的下调作用;caspase-1/PI荧光双染结果说明千Mfn2 shRNA能够削弱千层纸素A对肝细胞焦亡的抑制作用。[研究结论]千层纸素A通过上调PGC-1α/Mn2信号通路恢复线粒体功能,减少线粒体损伤,抑制线粒体过氧化物堆积,从而抑制下游NLRP3/caspase-1/GSDMD通路活化,缓解肝细胞焦亡;同时千层纸素A通过上调Mfn2减少肝细胞内脂质沉积。本论文论证了 Mfn2在千层纸素A缓解酒精性肝炎中的重要作用,揭示了其中的调控机制,为将千层纸素A开发成为临床ALD治疗药物提供依据。