论文部分内容阅读
利用木质纤维素原料生产燃料乙醇已成为资源开发领域的研究热点。葡萄糖和木糖是木质纤维素水解液的主要糖分。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由于不具有完整的木糖代谢途径,因此只能代谢葡萄糖而不能代谢木糖,从而限制了其高效地利用木质纤维素类原料进行燃料乙醇的生产。通过原生质体融合技术可以对酿酒酵母进行改造从而获得能够代谢木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌株。然而,在原生质体融合过程中,融合子的筛选工作尤为重要,如何准确、迅速、简便地筛选出具有所需优良性状的融合子,是原生质体融合能否取得成功的一个重要环节。本文选择发酵性能优良的酿酒酵母W5和具有木糖代谢途径的休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)20335为出发菌株,通过原生质融合手段,疏通酿酒酵母木糖代谢流;并利用抗性标记及报告基因的双重标记,选育可以高效利用木糖、葡萄糖为混合碳源进行乙醇发酵,并使乙醇产量有所提高的酿酒酵母工程菌株。本试验中构建了两个附加体型质粒载体pZLY1和pZLY2。其中,质粒载体pZLY1大小为4949bp,含有G418抗性标记和报告基因GFP;质粒载体pZLY2大小为7713bp,含有Blasticidin抗性标记和报告基因gusA。通过醋酸锂转化法,分别将质粒载体pZLY1和pZLY2转化休哈塔假丝酵母20335和酿酒酵母W5,获得转化子。对二者的转化子进行原生质体融合,通过上述四种标记筛选原生质体融合子。最终筛选出10株融合株,其混合碳源乙醇得率均高于双亲株。其中,ZLYRHZ7的混合碳源乙醇得率最高,0.427g/g,比亲本株W5(乙醇得率0.311g/g)和20335(乙醇得率0.353g/g)分别提高了 37.3%和21.0%。本课题研究的成功,为原生质体融合子筛选方法的优化及酿酒酵母木糖代谢途径的改造提供了新的成功实例,为酿酒酵母的木糖代谢工程和木质纤维素的生物转化制取乙醇研究提供基础。