Stenotrophomonas maltophilias DHHJ角蛋白酶类型及Nano-Lc MS/MS解析

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近年来,角蛋白废弃物因其具有很高的蛋白含量而越来越得到人们的关注。对角蛋白废弃物进行大量的,有效的降解成为了研究的热点。其中,利用微生物降解角蛋白废弃物更是因为其降解条件温和,能耗低,可以大量应用,产物利于纯化以及对环境无污染等特点而受到了广泛的关注。但是对于微生物降解角蛋白的机制目前还是世界性的难题。本论文以本课题前期试验分离得到的降解角蛋白的菌株嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ为研究对象,研究其降解角蛋白的降解机制,包括不同发酵培养基条件下的酶活的变化情况以及菌体表而的形态变化情况;以及利用不同的纯化手段对所得的粗酶液进行纯化,进而对纯化的酶液进行蛋白质质谱分析得到其肽段序列,为后续研究奠定基础。将该菌分别在牛肉膏蛋白胨培养基和羽毛培养基中利用发酵罐进行发酵培养,同时测得其胞内酶和胞外酶的酶活。证明该菌所分泌的角蛋白酶为一种诱导酶。但是其也有一定的组成性表达并少量分泌到培养基中,这同时也证明了羽毛并不是该菌所分泌的角蛋白酶的唯一底物。同时利用扫描电镜观察该菌在上述两种培养基中的表面形态的变化情况,发现该菌在两种培养基上都能观察到细菌表面产生一定的凹陷。但是,通过对比两种培养基培养中该菌表面形态的变化,羽毛培养基条件下该菌所产生的凹陷程度更明显,数量也更多。根据这些可以推测出该菌对于角蛋白的降解机制,一方面有该菌分泌角蛋白酶到外界环境中降解角蛋白,另一方面,该菌能够改变其细胞膜的表面形态来吸收外界降解的角蛋白小分子至细胞内进行进一步的降解,同时,胞内酶起到了促进胞外酶分泌的作用。对嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ进行发酵后对其发酵液中的胞外酶进行初步的纯化研究。首先经过盐析,溶液中硫酸铵饱和度在0%-20%之间对角蛋白酶有较好的分离度。之后分别以CHT羟基磷灰石和DEAE离子交换为分离介质对经过盐析的角蛋白酶进行进一步纯化,发现DEAE离子交换介质对于角蛋白酶的初步分离具有更好的效果,之后将经过DEAE离子交换纯化过的角蛋白酶溶液通过G-50葡聚糖凝胶,表明G-50葡聚糖凝胶不能再次分离角蛋白酶和其他的杂蛋白,所以本研究将纯化条件限定为盐析纯化和DEAE离子交换纯化。将经过DEAE柱层析纯化过的角蛋白酶进行蛋白质质谱分析,分析报告表明,陔角蛋白酶中可能含有一个大多数水解酶都具有的功能结构域-α/β折叠水解结构域,该结构域可能在角蛋白酶降解角蛋白过程中起到关键的作用。α/β折叠水解结构域分子量大约为31kDa,其与SDS-PAGE中所得的蛋白条带存在一定的差异,这可能是因为角蛋白酶在纯化过程中会产生一定的降解,SDS-PAGE中20kDa以下出现了一片蛋白质的弥散条带验证了这一想法。同时一些磷酸盐结合蛋白、外膜蛋白H1、外膜孔蛋白、胞外溶质结合蛋白、周质氨基酸转运蛋白、ompF蛋白家族、ABC转运底物结合蛋白等在嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ降解角蛋白的过程中也起到了一定的作用。
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