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肺癌是最常见的人类恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率在世界范围内呈现出逐年上升趋势。在肿瘤细胞中,脂质的分解与合成代谢异常对肿瘤的发生发展起到非常重要的影响。脂肪β-氧化过程中,其关键酶是肉碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyltransferase,CPT)。CPT 有两种形式包括 CPT1 和 CPT2,其中 CPT1 是脂肪酸β氧化的限速酶,用于催化肉碱和酰基结合形成酰基肉毒碱。CPT1在多种肿瘤的发生发展过程中起到重要的作用,这使得CPT1可能成为肿瘤诊断的分子标志物和抗肿瘤治疗的新靶点。乙莫克舍(Etomoxir)是CPT1的不可逆抑制剂,可以抑制CPT1的活性。顺铂(Cisplatin)是最广泛使用最广泛的肺癌化疗药物之一。通过前期实验发现,敲低CPT1可以促进肿瘤细胞对Cisplatin的敏感性。最新一代基因编辑技术,即 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins 9(CRISPR/Cas9)系统有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点,在动物模型构建、细胞系建立及精准治疗等方面前景非常广阔。本研究的目的:①利用CPT1的小分子抑制剂Etomoxiir,通过影响CPT1活性,进而影响并协同常规化疗药物Cisplatin,提高肿瘤细胞对该化疗药的敏感性,抑制肿瘤细胞增殖并促进凋亡,从而为提高非小细胞肺癌化疗效果提供新的方案。(②利用CRISPR/Cas9技术建立敲除CPT1A(CPT1的一种亚型)的肺癌细胞模型,为进一步研究其在肺癌发生发展中的作用提供可靠工具。同时,本研究通过体外实验,研究化疗药物Cisplatin与CPT1小分子抑制剂Etomoxir对肿瘤细胞增殖及迁移的影响;通过小鼠体内实验探究化疗药物Cisplatin与CPT1小分子抑制剂Etomoxir治疗对小鼠肿瘤增殖及迁移的治疗效果。并且通过CRISPR/Cas9技术对非小细胞肺癌H1299细胞系进行基因编辑,建立靶向敲除CPT1A的细胞系,为后续研究CPT1A基因在肿瘤细胞内的功能机制奠定基础。首先我们分别用不同浓度的Cisplatin及Etomoxir对人类非小细胞肺癌细胞系H1299和A549细胞进行药物处理,通过CCK8实验检测不同浓度药物对H1299和A549细胞增殖的影响,确定Cisplatin及Etomoxir在后续实验中的药物工作浓度。进一步,我们对非小细胞肺癌A549细胞系进行AnnexinV/PI染色,利用流式细胞术检测经过单独使用Etomoxir或单独使用Cisplatin及Cisplatin联合Etomoxir的这三种药物处理方式进行处理后的肺癌A549细胞系的细胞凋亡情况;同时,通过transwell实验检测经过上述三种药物处理方式进行给药处理后的肺癌A549细胞系的细胞迁移能力。另外,在本实验中,为了探究药物处理对A549细胞干性基因表达情况的影响,我们对经过单独使用Cisplatin,单独使用Etomoxir及Cisplatin联合Etomoxir使用的这三种药物处理方式进行处理后的肺癌A549细胞进行蛋白质提取,并利用WesternBlot检测A549细胞内的干性基因,即Oct4,Sox2及Nanog蛋白表达情况。最后在裸鼠的A549肺癌皮下成瘤动物模型上,检测不同药物治疗方式,即腹腔单独Cisplatin给药,Etomoxir及联合Etomoxir及Cisplatin给药后,对小鼠皮下移植瘤生长和肺转移的影响。为了进一步研究CPT1A基因产生上述影响的机制,我们又通过CRISPR/Cas9技术建立敲除CPT1A基因的H1299细胞系。通过http://crispr.mit.edu/网站设计靶向人CPT1A基因的sgRNA并将其克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX335和质粒PLenti-Guide-puro中。随后,将上述得到的质粒分别转染或感染至人类非小细胞肺癌H1299细胞后得到敲除CPT1A基因的H1299细胞混合克隆,提取H1299细胞混合克隆的基因组DNA。然后,进一步验证sgRNA的切割活性,利用PCR法及Western Blot法等对CPT1A基因及蛋白进行检测,最终得到敲除CPT1A基因的单克隆细胞。我们得出研究结果如下:1.A549细胞在经过CPT1抑制剂Etomoxir处理后,细胞增殖受到抑制;A549细胞在经过化疗药物Cisplatin处理后,细胞增殖受到抑制;H1299细胞在经过CPT1抑制剂Etomoxir处理后,细胞增殖受到抑制;H1299细胞在经过化疗药物Cisplatin处理后,细胞增殖受到抑制。2.经过Cisplatin联用Etomoxir后,相比于单独使用Cisplatin,A549细胞生长受到明显抑制;Cisplatin联用Etomoxir后,相比于单独使用Cisplatin,H1299细胞生长受到明显抑制。3.经过Cisplatin联用Etomoxir后,A549细胞细胞凋亡明显增加。4.经过Cisplatin联用Etomoxir后,A549细胞迁移能力受到明显抑制。5.A549细胞经过Etomoxir处理后,Oct4,Sox2和Nanog蛋白表达受到明显抑制;经过Cisplatin联用Etomoxir后,Oct4,Sox2和Nanog蛋白表达与单独使用Etomoxir处理无明显变化。6.经过Cisplatin联用Etomoxir治疗后,裸鼠皮下成瘤模型的肺癌肿瘤的生长受到明显抑制。7.通过CRISPR/Cas9技术的双质粒系统,H1299细胞的CPT1A基因被稳定敲除,且基因编辑效率较高。综上所述,Cisplatin联合Etomoxir使用后可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,从而降低肺癌细胞增殖能力,增强肺癌细胞凋亡能力,增强肺癌细胞迁移能力,并在裸鼠肺癌皮下成瘤模型中表现出抑制肺癌肿瘤生长;同时,使用Etomoxir后可以使肿瘤细胞干性基因表达下调;另外,使用CRISPR/Cas9双质粒系统建立了敲除人类CPT1A基因的细胞系,为后续深入分子机制和基因治疗研究奠定实验基础。