背景与目的结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,淋巴道转移是其最常见的转移方式。目前肿瘤的淋巴结转移和淋巴管生成的分子机制尚不清楚。Neuropilins（NRPs）为跨膜糖蛋白,首先证实为神经导向因子semaphorins3（Sema）的主要受体,近来发现它也是某些特殊亚型的血管内皮生长因子(如VEGF₁₆₅、VEGF₁₄₅和VEGF-C等)的一种复合受体。目前研究发现NRPs具有两种功能:在神经导向中,NRP2只与Sema3F结合引起颈上神经节阻斥。在脉管生成中,NRPs为近年发现的VEGF新型受体,常与VEGF₁₆₅结合诱导血管生成。这样两个不同的配体（Sema和VEGF）结合同一受体（NRPs）,并介导两个不同的过程——神经导向和血管生成,提示这些过程可能具有共同的分子机制。NRPs在胚胎脉管发育中也具有重要作用,其中NRP2与淋巴管发生密切相关。已发现在纯合子NRP2突变动物,出现小淋巴管和毛细淋巴管缺乏或数量减少,而血管系统和其他的大集合淋巴管发育正常。提示NRP2对胚胎淋巴管发育具有一种选择性的需要。进一步研究发现胚胎早期从静脉出芽形成的原始淋巴管并不需要NRP2参与,而在其后期从原有淋巴管内皮出芽形成新生淋巴管的过程中NRP2却十分必要。表明NRP2对成熟组织的毛细淋巴管形成具有非常重要的作用。然而在神经轴突导向中,Sema3F与NRP2结合所激发的信号转导却引起神经元轴突生长锥萎缩。Sema3F对表达NRP2的结肠淋巴管内皮细胞来说,是否也同样存在类似轴突阻斥方式,从而抑制肿瘤淋巴管生成。为此推测Sema3F通过NRP2介导的信号不仅抑制神经元轴突生长,也可能抑制肿瘤的淋巴管生成和肿瘤细胞淋巴管转移。在本研究中,我们检测NRP2介导的Sema3F信号对结肠癌淋巴管生成及转移的影响,初步探讨其在结肠癌淋巴管生成和淋巴结转移中的潜在作用和机制,从而对结肠癌发生淋巴道转移的机制进行初步探讨。研究方法首先,通过免疫组化的方法,检测结肠癌组织中NRP2、Sema3F和VEGF-C的表达情况,同时利用统计学方法,分析NRP2和Sema3F表达同VEGF-C表达、淋巴管密度（Microlymphatic density,MLD）、淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cells,LECs）增殖、淋巴结转移情况以及其他一些临床病理特征的相关性。其次,构建NRP2和VEGF-C的RNAi真核载体,并对结肠癌LOVO细胞进行Sema3F转染、NRP2 RNAi和VEGF-C RNAi;同时采取双转染的方法对结肠癌细胞进行Sema3F转染+NRP2/VEGF-C RNAi,筛选相应稳定表达克隆。建立裸鼠结肠原位种植的荷瘤模型。比较转染组与对照组种植瘤在淋巴管生成、淋巴结转移、细胞增殖与凋亡方面的差异。最后,采用免疫磁珠法分离毛细人淋巴管内皮细胞（human lymphatic endothelialcells,hLECs）,并分别转染NRP2的表达和RNAi干扰载体,筛选相应稳定表达克隆。然后采用三维小管培养和体外迁移实验,以及转染Sema3F的结肠癌细胞与hLECs共培养等方法,观察NRP2不同表达水平的hLECs体外小管形成能力和迁移能力的差异,以及与肿瘤细胞间的相互作用能力的差异。采用western blot和RT-PCR检测NRP2不同表达状态的hLECs的integrinα_vβ3表达水平,初步探讨其机制。结果1.podoplanin阳性定位于结肠癌及正常结肠组织LECs的胞膜和胞质。结肠癌MLD均值为29.5±12.2,与正常结肠组织（25.4±8.0）无显著性差异（P＞0.05）;肿瘤边缘组织、肿瘤浅表部和肿瘤中心区MLD均值分别为48.8±23.5、24.6±10.1和11.3±7.7,三者间有显著差异（P＜0.05）;肿瘤边缘淋巴管多为扩张状,而肿瘤中心及浅表部位则多为闭锁的条索状。结肠癌组织中LECs的Ki-671abel index（LI）为0.17±0.12,而正常结肠组织hLECs几乎没有Ki-67表达。LECs的Ki-67 LI以肿瘤边缘区最高（0.22±0.12）,肿瘤中央区最低（0.12±0.08）,肿瘤浅表区为0.15±0.10,其中肿瘤边缘区Ki-67 LI与肿瘤浅表区和中心区差异有显著性（P＜0.05）。2.肿瘤组织NRP2的mRNA表达为0.87±0.26高于其癌旁正常组织的0.38±0.12（p＜0.01）;转移组癌组织NRP2的mRNA水平为1.12±0.25高于非转移组的0.76±0.19（p＜0.01）)。免疫组化检测NRP2主要见于癌细胞和LECs胞质,阳性率34.8%,MLD与NRP2表达强度正相关（r=0.432,P＜0.01）。NRP2的表达和MLD与结肠癌组织淋巴结转移、Duke’s分期和侵润程度相关（P＜0.05）,与患者年龄、肿瘤分化程度、性别、肿瘤大小和部位不相关（P＞0.05）。3.肿瘤组织Sema3F的mRNA表达为1.26±0.17高于其癌旁正常组织的1.17±0.15（p＞0.05）;转移组癌组织Sema3F的mRNA表达水平为1.20±0.16低于非转移组的1.38±0.22（p＜0.05）;免疫组化检测Sema3F主要见于癌组织,其中13例可见部分肿瘤和间质细胞核阳性着色,64例标本中阳性率50%。Sema3F⁺组肿瘤组织MLD为21.8±10.2显著低于Sema3F^-组的33.5±12.6（p＜0.05）。Sema3F的表达和MLD与结肠癌组织淋巴结转移、肿瘤分化程度、Duke’s分期和侵润程度相关（P＜0.05）,与患者年龄、性别、肿瘤大小和部位不相关（P＞0.05）。4.结肠癌组织Smea3F表达与NRP2表达呈负相关（r=0.099,P=0.013）,VEGF-C表达与NRP2表达呈正相关（r=0.174,P=0.001）,但Smea3F表达与VEGF-C表达呈负相关（r=0.606,P=0.001）。5.成功构建NRP2和VEGF-C的RNAi真核载体,顺利转染结肠癌LOVO细胞。转染组与对照组相比,NRP2和VEGF-C基因的mRNA抑制率分别为76.5%和38.6%、77.3%和75%。NRP2和VEGF-C基因的蛋白抑制率分别为74.9%和33.4%、76.6%和74.5%6.顺利对LOVO细胞转染Sema3F基因、NRP2 RNAi和VEGF-C RNAi载体;同时对LOVO细胞共转染Sema3F+NRP2/VEGF-C RNAi载体。LOVO细胞裸鼠移植瘤与对照组移植瘤相比较,生长相同天数后,未转染组MLD高于转染组,并有统计学意义（p＜0.05）。对照组全部出现转移,单纯干扰VEGF-C、NRP2组裸鼠未见肠系膜淋巴结的肿大,但肿瘤细胞种植超过8周以上,也发现各有6/12和7/12的淋巴结转移,并逐渐出现远处器官转移。单纯转染Sema3F组仅于肿瘤细胞种植后12周有膈肌转移灶,并有2个淋巴结的转移。共转染Sema3F+NRP2 RNAi的种植瘤于第8周也逐渐出现淋巴结转移、远处器官转移。但共转染Sema3F+VEGF-C RNAi的移植瘤未见肿瘤的远处转移和微转移灶。表达sema3f的裸鼠移植瘤出现腺管样结构,坏死灶间隙由大量的凋亡细胞和无增殖活性细胞组成。7.成功分离纯化毛细hLECs,免疫荧光检测显示hLECs表达D2-40、VEGFR3、NRP2、podoplnain和LYVE-1,但不表达Ⅷ因子;VEGF-C（10ng/ml）诱导组hLECs较对照组S期、G₂/M期的细胞显著增多（p＜0.05）。8.顺利对hLECs转染NRP2表达载体和NRP2 RNAi的载体。在体外实验中,NRP2过表达的hLECs小管成型、细胞迁移和细胞粘附能力较下调NRP2和未干预的hLECs增强,且其integrinα_vβ₃表达水平也上调,但对hLECs的增殖能力没有影响。表达Sema3F的LOVO细胞对NRP2过表达和未干预的hLECs出现化学排斥,而与下调NRP2的hLECs能融合生长。结论1.NRP2、Sema3F和VEGF-C在结肠癌组织中表达,并且和肿瘤淋巴管生成、淋巴结转移存在相关性,Sema3F表达与NRP2和VEGF-C表达呈负相关,NRP2表达与VEGF-C表达呈正相关。2.成功构建NRP2和VEGF-C的RNAi真核载体对结肠癌LOVO细胞的NRP2和VEGF-C基因的mRNA和蛋白有明显抑制作用。3.Sema3F可诱导结肠癌细胞呈良性分化,并通过与NRP2结合抑制结肠癌细胞的淋巴管生成与淋巴结转移;Sema3F与VEGF竞争性结合NRP2而抑制其促淋巴管生成。4.成功分离纯化和鉴定hLECs,并建立hLECs三维培养、hLECs和肿瘤细胞共培养模型。5.NRP2可通过上调integrinα_vβ₃的表达促进hLECs的细胞粘附、迁移和小管形成能力;Sema3F与NRP2结合诱导肿瘤细胞对hLECs化学排斥,具有抑制NRP2促淋巴管生成的能力。