大黄鱼（Larimichthys crocea）作为我国重要的经济海洋鱼类,目前面临严重的种质退化现象,而通过建立大黄鱼肌肉组织的cDNA文库,开展EST测序分析,可能在短期内获得大量大黄鱼肌肉组织的功能基因表达信息,这些数据为进一步筛选和克隆大黄鱼肌肉特异性表达基因提供了平台。 本实验以大黄鱼肌肉组织为材料,利用Creator Smart cDNA Library Construction Kit构建了大黄鱼肌肉组织全长cDNA文库,并对大黄鱼肌肉组织全长cDNA文库进行EST测序、生物信息学分析。通过本实验,得到以下结论: 文库质量分析表明:cDNA文库容量不低于1.6×106cfu/ml,重组率达96%,插入片断的平均长度大于1000bp,完全符合一个cDNA文库的标准。随机挑取4006个阳性克隆进行5’端测序,去除低质量的序列和载体序列后,共获得3355条高质量的cDNA序列,平均长度为506bp,平均插入长度为416bp。经Blastx检索NCBI及SWISSPROT蛋白质数据库,284个ESTs在Blastx上无明显的同源性,为新基因,3071个ESTs与已报道的基因有较高的同源性,代表317条同源蛋白。对317条同源蛋白按照其分子功能做GO分类,结果显示:与细胞骨架相关基因的ESTs丰度最高,占总数的27.68%;能量和信号传导次之,比例分别为22.82%、20.68%。其中表达丰度最高的是肌球蛋白轻链,肌酸激酶,肌球蛋白重链,α-原肌球蛋白,细胞色素C氧化酶等。通过引物设计成功克隆到大黄鱼CD53基因及白细胞介素8基因的全长cDNA序列,这是该基因在大黄鱼上的首次报道。 克隆到的CD53基因全长为1210bp,其中5′-UTR 113bp,3′-UTR 422bp,编码序列675bp,编码224个氨基酸,理论分子量为24.77 KDa,理论等电点为5.07。生物信息学分析显示大黄鱼CD53存在4次跨膜结构,N端和C端都位于细胞膜内,膜外有两个亲水环,跨膜区域为疏水区域,两个N-糖基化位点都位于靠近C端的亲水环上,符合TM4SF家族特征。大黄鱼CD53氨基酸序列具非常高的保守性,与三刺鱼、斑马鱼、虹鳟等多种鱼类的相似性在70℅以上。用常规RT-PCR检测了CD53在大黄鱼成体的表达情况,CD53基因主要在肠、脾、肾、肝中表达,其次为肌肉,在脂肪、鳃、眼、脑中都未检测到表达。 克隆获得白细胞介素8（IL-8）基因的全长为2582bp,其中5′-UTR 106bp,ExonⅠ52bp,IntronⅠ133bp,ExonⅡ133bp,IntronⅡ149bp,ExonⅢ87bp,IntronⅢ682bp,Exon IV13bp,3′-UTR 1191bp,编码序列285bp,编码94个氨基酸,理论分子量为10.55 KDa,理论等电点为9.64。该序列包含4个半胱氨酸残基,其中前2个半胱氨酸残基被1个精氨酸分开,形成CRC结构,与趋化性因子CXC家族的特征结构域特征吻合。用常规RT-PCR检测了IL-8在大黄鱼成体的表达情况,IL-8在大黄鱼中的7个组织有表达,其中表达量较高的为肾、肝、肠、脾,其次为脑,心、肌肉微量表达。