论文部分内容阅读
目的:应用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）干扰急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60的JARID1B表达,研究JARID1B基因干扰对HL-60细胞增殖和凋亡以及对组蛋白甲基化、乙酰化修饰的影响,探寻白血病基因治疗的新方法。方法:（1）设计四个针对JARID1B基因的小干扰RNA片段,经LipofectamineTM2000脂质体转染HL-60细胞,RT-PCR的方法筛选出最佳干扰片段。（2）应用四唑盐（MTT）法绘制细胞生长曲线,观察JARID1B siRNA对HL-60细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞的凋亡。（3）Western blot检测JARID1B siRNA作用后凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-9、procaspase-3、C-myc及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白P27表达水平的变化、组蛋白H3K4甲基化及组蛋白H3、H4乙酰化状态变化。结果:（1）转染8小时后,转染效率高达93%±2.56%,采用RT-PCR法筛选出最佳的siRNA为JARID1B-1509,其序列为Sense5’-GGAGCUAUUCAAUU AACUATT-3’ Anti-sense5’-UAGUUAAUUGAAUAGCUCCAG-3’。（2）JARID1B siRNA致HL-60细胞原癌基因c-myc的表达下降,P27的表达上调,抑制HL-60细胞的增殖,作用24小时半数抑制浓度（IC50）约为60nM,且随着浓度增加、作用时间延长,抑制率也逐渐上升。（3）JARID1B siRNA可引起HL-60细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-9、procaspase-3改变,出现细胞凋亡,且随着浓度的增加,凋亡率也逐渐上升。（4）JARID1B siRNA可引起HL-60细胞的JARID1B蛋白及JARID1B mRNA表达水平的降低,同时组蛋白H3K4甲基化水平增加及组蛋白H3的乙酰化水平也稍微上调,组蛋白H4的乙酰化水平无显著变化。结论:（1）LipofectamineTM2000脂质体介导JARID1B siRNA导入HL-60细胞具有转染率高、方法简便等特点。（2）运用RNAi技术,可以有效地干扰HL-60细胞中JARID1B的表达,抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,使得RNAi技术有望成为白血病靶向基因治疗的新工具,同时JARID1B基因也可以成为白血病靶向基因治疗的新靶点。（3）JARID1B siRNA能够上调组蛋白H3K4甲基化和组蛋白H3乙酰化,对组蛋白H4乙酰化无明显影响。JARID1B基因上调组蛋白乙酰化水平的机制还有待进一步研究。