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骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是在儿童、青少年等群体骨骼系统中较为常见的原发性、恶性肿瘤。随着化疗、靶向治疗、手术治疗、免疫治疗、中药治疗、肢体重建等技术手段的发展,OS患者保持肢体功能治疗的生存率明显提高,然而OS患者肿瘤细胞增殖、迁移、形成新生肿瘤血管的机制较为复杂,肿瘤发生进展过程仍牵涉繁琐复杂的网状信号转导通路,因此对于OS的发病机制仍需要深层次的研究。近年来,炎症介质及相关细胞因子在OS肿瘤发展形成过程中的研究日益受到关注,环氧化酶（Cyclooxygenase,COX）为重要的炎症介质,在花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）向前列腺素H2（Prostaglandins H2,PGH2）这一转化过程中,COX为限速酶。PGE2是花生四烯酸通过COX-2催化后其主要代谢产物,PGE2作为一种炎症介质在体内广泛分布,在肿瘤发展进程中,白细胞三烯及PGE2以自分泌和旁分泌方式,在多个信号转导通路中发挥两者对肿瘤细胞增殖、分化以及凋亡过程的调控作用。通过与EP受体的特异性结合,PGE2发挥其生理效应,EP受体可分为EP1、EP2、EP3、EP4四种亚型,EP1受体属于G蛋白偶联受体家族,EP1受体能够介导Ca2+调控信号转导。EP1受体与肝癌、皮肤癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌症密切相关。在人Hep G2、Hep3B肝癌细胞中,EP1受体表达水平在EP四种受体中最丰富,EP1受体的特异性拮抗剂ONO-8713呈剂量依赖性抑制人Hep G2、Hep3B肝癌细胞增殖活性,具有诱导人Hep G2、Hep3B肝癌细胞凋亡的作用。在乳腺癌患者组织中,EP1受体参与了血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）调控过程,此外EP1受体与肿瘤组织新生血管形成、肿瘤细胞分化增殖密切相关。然而在骨肉瘤中,PGE2是否在骨肉瘤的进展过程中,参与肿瘤细胞的恶性增生,尚不明确,以EP1受体为靶点是否能够为临床开发高效、高选择性、低毒的抗骨肉瘤治疗手段尚缺乏一定的实验依据。本课题建立骨肉瘤荷瘤裸鼠模型,以人骨肉瘤细胞为研究细胞,运用流式细胞术、酶联免疫反应、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）、免疫组化、免疫印迹、激光共聚焦等技术,观察EP1受体参与骨肉瘤细胞生长机制研究。以期为临床开发高效、高选择性、低毒的抗肿瘤治疗手段提供一定的实验依据。目的:以人骨肉瘤细胞为研究细胞,运用流式细胞术、酶联免疫反应、TUNEL、免疫组化、免疫印迹、激光共聚焦等技术,观察EP1受体参与骨肉瘤细胞生长机制研究。方法:（1）设计EP1 m RNA的特异性引物,采用RT-PCR检测人骨肉瘤细胞MG63、OS732、143B、U-2OS,人胎儿成骨细胞h Fob1.19中EP1m RNA的表达水平。（2）Western Blot方法检测人骨肉瘤细胞MG63、OS732、143B、U-2OS,人胎儿成骨细胞h Fob1.19中EP1的表达水平。（3）将MG63细胞接种于24孔培养板中,每孔接种2×104个细胞,处理组采用PGE2（5μM）,17-PT-PGE2（5μM）,对照组细胞采用0.5%DMSO处理。采用PKC活性检测盒检测EP1受体激动剂对MG63细胞蛋白激酶C的影响。（4）取96孔培养板,每孔接种10000个MG63细胞,处理组采用PGE2（5μM）,17-PT-PGE2（5μM）,对照组细胞采用0.5%DMSO处理。48h后MTT法检测EP1受体激动剂对MG63细胞增殖的影响。（5）将MG63细胞接种于24孔培养板中,每孔接种2×104个细胞,处理组采用17-PT-PGE2（5μM）,和17-PT-PGE2（5μM）+SC51809（2μM）。处理48小时后,采用PKC活性检测盒检测MG63细胞中EP1下游分子PKC活性。（6）取96孔培养板,每孔接种10000个MG63细胞,处理组采用17-PT-PGE2（5μM）,和17-PT-PGE2（5μM）+SC51809（2μM）。随后将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中培养,48h后MTT法检测MG63细胞增殖。（7）取24孔培养板,每孔接种20000个MG63细胞,采用PGE2（5μM）,17-PT-PGE2（5μM）处理,对照组细胞采用0.5%DMSO处理,48h后TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡情况。（8）取24孔培养板,每孔接种20000个MG63细胞,处理组采用17-PT-PGE2（5μM）和17-PT-PGE2（5μM）+SC51809（2μM）。48h后TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡情况。（9）Western Blot方法检测人骨肉瘤细胞MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）、EP1-si RNA+PGE2（5μM）中EP1的表达水平。（10）取96孔培养板,每孔接种10000个MG63细胞,处理组采用MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）、EP1-si RNA+PGE2（5μM）,48h后MTT法检测对MG63细胞增殖的影响。（11）取24孔培养板,每孔接种20000个MG63细胞,处理组采用MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）、EP1-si RNA+PGE2（5μM）。48h后TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡情况。（12）采用Western Blot法检测人骨肉瘤细胞MG63、si RNA对照、EP1-si RNA中凋亡相关蛋白的表达水平。（13）在雄性BALB/c裸鼠,裸鼠腋窝处接种5 x107个MG63细胞,接种完成后接种部位形成皮丘,待裸鼠肿瘤直径达到3-5mm左右时,随机将裸鼠分为对照组及用药组（SC51809）,用药组每日给药2 mg/kg,给药21天,给药期间每隔三天使用游标卡尺测量肿瘤,并按下列方法计算肿瘤体积,肿瘤体积=0.44×长径×短径2。（14）采用PKC活性检测盒检测SC51809对MG63荷瘤裸鼠中PKC活性的影响。（15）TUNEL荧光染色法检测SC51809对MG63荷瘤裸鼠中肿瘤组织凋亡情况。（16）Western Blot检测SC51809体内对MG63荷瘤裸鼠中肿瘤组织凋亡相关蛋白的影响。结果:（1）与人胎儿成骨细胞h Fob1.19相比,人骨肉瘤细胞MG63、OS732、143B、U-2OS中EP1 m RNA的表达水平显著增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。（2）人骨肉瘤细胞MG63中EP1的表达水平较人骨肉瘤细胞OS732、143B、U-2OS高,差异具有统计学意义（P<0.01）。（3）17-PT-PGE2组、PGE2组PKC活性水平较对照组高,17-PT-PGE2、PGE2增强了MG63细胞中PKC的活性,差异具有统计学意义（P<0.01）。（4）17-PT-PGE2组、PGE2组增殖水平较对照组高,17-PT-PGE2、PGE2增强了MG63细胞的增殖活性,差异具有统计学意义（P<0.01）。（5）17-PT-PGE2组PKC活性水平较17-PT-PGE2+SC51809组高,差异具有统计学意义（P<0.01）,SC51809组降低了17-PT-PGE2诱导的MG63细胞PKC活性。（6）17-PT-PGE2组增殖水平较17-PT-PGE2+SC51809组高,差异具有统计学意义（P<0.01）,SC51809组降低了17-PT-PGE2诱导的MG63细胞增殖。（7）17-PT-PGE2组、PGE2组观察到的凋亡细胞数量较对照组低,计算细胞凋亡率,17-PT-PGE2组、PGE2组观察到的凋亡率较对照组低,17-PT-PGE2、PGE2增强了MG63细胞的抗凋亡活性,差异具有统计学意义（P<0.01）。（8）17-PT-PGE2组凋亡水平较17-PT-PGE2+SC51809组低,差异具有统计学意义（P<0.01）,SC51809组降低了17-PT-PGE2诱导的MG63细胞抗凋亡活性。（9）MG63 EP1-si RNA+PGE2中EP1的表达水平较MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）中低,差异具有统计学意义（P<0.01）。（10）MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）组增殖水平较EP1-si RNA+PGE2（5μM）组高,其差异具有统计学意义（P<0.01）,提示沉默EP1受体能够降低MG63细胞增殖。（11）EP1-si RNA+PGE2组凋亡水平较MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）组高,其差异具有统计学意义（P<0.01）,提示沉默EP1受体能够诱导MG63细胞凋亡。（12）MG63 EP1-si RNA较MG63、si RNA对照中Bax、cytoplasmic cyt c、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9的表达水平显著升高,MG63 EP1-si RNA较MG63、si RNA对照中Bcl-2、mitochondrial cyt c表达水平显著降低,其差异具有统计学意义（P<0.01）。（13）SC51809对MG63荷瘤裸鼠中的的肿瘤体积和平均肿瘤重量具有抑制作用,与对照组相比SC51809组裸鼠的肿瘤体积、肿瘤重量较小,差异具有统计学意义（P<0.01）,SC51809对MG63荷瘤裸鼠中的肿瘤生长具有抑制作用。（14）SC51809组PKC活性水平较对照组低,其差异具有统计学意义（P<0.01）。SC51809组降低了MG63荷瘤裸鼠PKC活性。（15）SC51809组观察到的凋亡率较对照组高,SC51809在体内具有诱导MG63细胞凋亡作用,其差异具有统计学意义（P<0.01）。（16）MG63荷瘤裸鼠肿瘤组织中SC51809组较对照组中Bax、cytoplasmic cyt c、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9的表达水平显著升高,MG63荷瘤裸鼠肿瘤组织中SC51809组较对照组中Bcl-2、mitochondrial cyt c表达水平显著降低,其差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:（1）EP1受体激动剂、PGE2能够抑制MG63细胞凋亡,EP1受体抑制剂对17-PT-PGE2诱导的MG63细胞凋亡活性增强,阻断EP1受体能够抑制17-PT-PGE2诱导的MG63细胞增殖,促进17-PT-PGE2诱导的MG63细胞凋亡,沉默EP1能够抑制PGE2诱导的MG63细胞增殖,促进PGE2诱导的MG63细胞凋亡,提示EP1参与了PGE2、17-PT-PGE2诱导的MG63肿瘤细胞的增殖与凋亡。（2）人骨肉瘤细胞MG63中EP1表达水平较高。（3）EP1受体激动剂、PGE2能够增强MG63细胞蛋白激酶C表达水平以及增殖活性,EP1受体抑制剂能够抑制蛋白激酶C表达水平以及增殖活性。（4）SC51809体内能够抑制MG63荷瘤裸鼠中的的肿瘤生长,降低肿瘤组织PKC活性水平,诱导肿瘤肿瘤凋亡,介导凋亡相关蛋白的调控。