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作为一种胰蛋白酶抑制剂,丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅰ(serine peptidase inhibitor,Kazal type 1,SPINK1)的空间结构与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的非常相似。研究表明,SPINK1的生物学功能也类似于EGF,能够促进正常细胞和癌细胞的增殖和分化。本实验室采用大鼠全基因组芯片Rat Genome 230 2.0检测2/3部分肝切除(partial hepatectomy,PH)后再生肝肝细胞的基因表达谱,发现Spink1在肝切除后的6、24和72 h表达显著上调。众所周知PH后6-72 h肝细胞增殖明显,表明Spink1与大鼠再生肝肝细胞的增殖密切相关。基因组芯片检测二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DENA)诱导的大鼠肝癌细胞的基因表达谱,发现Spink1在诱导后的12和16 w表达显著上调,并且诱导后12-16 w肝细胞增殖明显,表明Spink1与大鼠肝癌细胞的增殖密切相关。然而,目前对SPINK1调控肝再生中肝细胞,以及肝癌细胞增殖的机理还不完全清楚。研究表明,SPINK1能够与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)相结合,调控细胞的增殖、分化和迁移等多种生理活动。本文通过免疫共沉淀(immunoprecipitation assay,IP)的方法也发现SPINK1能够与EGFR相结合。最近的研究表明EGFR被生长因子等激活后,能够通过p38MAPK、ERK、JNK、PKC、JAK-STAT和AKT等多条信号通路促进细胞的增殖。本文通过IPA(Ingenuity Pathway Analysis 9.0)软件,结合相关文献分析SPINK1与EGFR信号通路的互作网络,发现SPINK1可能与EGFR结合后通过上述6条信号通路调控细胞的增殖。为探究SPINK1调控肝细胞和肝癌细胞增殖的机理,本文通过基因添加的方法处理BRL-3A细胞,并用重组蛋白处理BRL-3A细胞和RH-35细胞,通过MTT、EdU、流式细胞术等方法检测SPINK1上调表达对上述两种细胞活力、增殖和周期等的影响,通过免疫共沉淀、qRT-PCR和western blot等方法推测SPINK1调控两种细胞增殖的机理。结果表明,通过基因添加的方法上调BRL-3A细胞内源性Spink1的表达后,细胞的生长活力和增殖,S期和G2/M期的细胞数量,细胞增殖和抗凋亡相关基因/蛋白的表达都明显增加,然而,G1期的细胞数量和促凋亡相关基因/蛋白的表达都明显减少。通过qRT-PCR和western blot等方法检测SPINK1信号通路相关基因/蛋白的变化,发现p38,ERK和JNK信号通路相关基因/蛋白的表达发生显著的变化。当用外源性的重组大鼠SPINK1蛋白(rat recombinant SPINK1,rrSPINK1)处理BRL-3A细胞时,所得到的结果与上述结果相似。当用rrSPINK1处理RH-35细胞时,我们发现与处理BRL-3A细胞所得到的结果相似,RH-35细胞的生长活力和增殖,S期和G2/M期的细胞数量,细胞增殖和抗凋亡相关基因/蛋白的表达都明显提高,G1期的细胞数量和凋亡相关基因/蛋白的表达都明显减少。qRT-PCR和western blot检测结果表明,在RH-35细胞中,p38和JAK-STAT3信号通路相关基因/蛋白的表达发生显著的变化。本文用pEGFR抗体处理稳定表达内源性Spink1的阳性单克隆BRL-3A细胞发现,该细胞的生长活力受到明显的抑制,并且抑制效果随着抗体剂量的增加愈加明显,进一步验证了SPINK1与EGFR结合后发挥其相应的功能。综上所述,SPINK1与EGFR结合后通过p38、ERK和JNK等3条信号通路调控细胞增殖相关基因/蛋白MYC和CCND1和凋亡相关基因/蛋白BAX,CASPASE3的表达,促进BRL-3A细胞的增殖;通过p38和JAK-STAT3等2条信号通路调控细胞增殖相关基因/蛋白MYC和CCND1和凋亡相关基因/蛋白CASPASE3的表达,进而促进RH-35细胞的增殖。