论文部分内容阅读
核酸适配体作为一种与抗体功能相似的新型配体,它们在疾病检测、新药研发、临床治疗及基因表达调控等多个领域具有良好的应用前景,成为近年来研究的热点之一。核酸适配体具有靶分子范围广、稳定性好、合成简单、易于修饰等特点。小分子目标物是一类很重要的靶分子,核酸适配体对小分子的特异性识别在医药、农业、食品安全和环境监测等方面都有着广泛的应用前景。但是小分子核酸适配体的筛选面临费时费力、成本高、筛选结果不理想等技术瓶颈,制约了它们的发展和应用。与此同时,微流控芯片作为一种新型的化学、生物分析检测平台得到了快速发展。因其具有快速、高效、高通量、低成本、低样品量、微型化、集成化等优点,特别是在分离领域具有独特的优势,所以越来越多地被用于核酸适配体的筛选。本论文以多西紫杉醇(DOC)作为筛选的靶分子,采用固定文库的筛选方法,同时搭建微流控芯片作为筛选平台,发展了一种简便、高效、易于操作的筛选小分子核酸适配体的方法,并对筛选得到的核酸适配体的特性进行了初步考察。研究内容包括:(1)为了简化整个筛选流程、提高筛选效率,设计了一种操作简便,无需外加分离装置的蛇形通道微流控芯片。首先在芯片表面利用生物素化捕获探针通过互补杂交的方式将DNA文库固定于通道表面,再通入目标物多西紫杉醇的溶液,与目标物结合的DNA链将被洗脱下来.,并在芯片出口处被收集。经过九轮的筛选,并对富集度较高的第五、六、七轮文库进行了TA克隆测序。(2)通过序列分析和亲和力、特异性的考察,获得了两条与多西紫杉醇亲和力和特异性较好的核酸适配体DOC6-5和DOC7-38,其解离常数分别为32nmol/L和66nmol/L,并初步推测核酸适配体有两个位点可与多西紫杉醇结合。此外,还考察了不同轮数的DNA文库对多西紫杉醇的增溶作用,富集度高的文库增溶作用比较明显,筛选出的核酸适配体DOC6-5可使多西紫杉醇的溶解度从5μg/mL增加到20μg/mL,且DOC6-5与多西紫杉醇复合物在水溶液中能够稳定存在。通过MTT实验和PI染色实验分别考察了DOC6-5与多西紫杉醇复合物对细胞的杀伤能力,结果表明复合物对A549细胞的杀伤能力比同浓度的多西紫杉醇效果好,半致死量(IC50)为1.49μg/mL。