论文部分内容阅读
本论文以产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌BF7658为研究对象,通过PCR技术获得了该菌的α-淀粉酶基因(amy),并成功的将该基因克隆到六蛋白酶缺陷菌株WB600中,实现了中温α-淀粉酶的高效表达,经过优化、放大培养后,工程菌所产酶活力比原出发菌株提高3.9倍。首先将获得的中温α-淀粉酶基因插入到大肠杆菌载体pET-22b(+)中,构建重组载体pET-amy并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。测序并对序列进行分析。该基因(Genebank接收号FJ463162)不含有信号肽,包含1,431个碱基,编码447个氨基酸。与GenBank中已报道的α-淀粉酶基因进行了比较,发现基因核苷酸序列相似性最高为92%,氨基酸序列的相似性最高为94%。以质粒pET-amy为模板,通过PCR技术扩增得到中温α-淀粉酶基因(amy)成熟肽,利用含有P43启动子,sacB信号序列,多克隆位点和卡那抗性基因的表达载体pWB980,构建重组表达质粒pWB-amy,以六蛋白酶缺陷菌株B. subtilis WB600作为宿主菌,首次实现了去信号肽的枯草芽孢杆菌BF7658中温α-淀粉酶基因(amy)在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达。经SDS-PAGE检测,重组酶(AMY)的分子质量为49.1 KDa,最适的作用温度和pH分别为60℃和6.0。该酶的酶活较出发菌株提高了184.2%。通过正交试验确定培养基最佳组合为豆饼粉3%、玉米粉5%、淀粉5%、氯化钙0.2%。摇瓶培养条件最佳组合为起始pH6.0、接种种龄18 h、接种量2%、装液量50 mL(500 mL三角瓶)、摇床转速220 r／min。基因工程菌株pWB-amy／WB600在最佳产酶条件下,产α-淀粉酶的活力最高可达630 U／mL,是优化前的1.5倍。初步确定了7L发酵罐上的工艺条件：接种量5%,装液量为60%,采用适宜的溶氧(溶氧浓度15-25%),适宜的pH值(pH值在6.0-7.5),并采用间歇流加补料的工艺,可大大提高酶的发酵活力,优化后的发酵液酶活达到了890 U／mL,比未优化时630 U／mL提高1.4倍。